热BRET:一种对GPCRs应用的干接触纳米级热稳定性试验
Bradley L Hoare1,2,3, David N Tippett1,2,4, Amandeep Kaur1,2
1Centre of Membrane Proteins and Receptors (COMPARE), University of Birmingham and University of Nottingham, Midlands, UK.
Chembiochem : a European journal of chemical biology
|October 24, 2023
概括
一种新的ThermoBRET测定量化了G蛋白合受体 (GPCR) 的热稳定性,没有标记的配体. 这种方法与未净化的蛋白质一起工作,有助于药物发现和蛋白质净化优化.
科学领域:
- 生物化学 生物化学
- 分子生物学分子生物学
- 药理学 药理学是指药理学的学科.
背景情况:
- 膜蛋白热稳定性测量对于了解带结合至关重要.
- 现有的热稳定性测试通常需要蛋白质净化或标记的连接体,从而限制了它们的范围.
- 替代方法,如光检测,大小排除色谱,热转移检测聚合,而不是展开,并不是高通量.
研究的目的:
- 开发一种新的,高通量方法来量化G蛋白合受体 (GPCR) 的热稳定性.
- 为了能够对未经净化的蛋白质和没有先前存在的标记连接体的目标进行热稳定性评估.
- 优化蛋白质净化策略,并促进对GPCRs的药物发现查.
主要方法:
- 开发了ThermoBRET (生物发光共振能量转移) 试验,使用纳米化酶 (Nluc) 与GPCRs融合.
- 使用一种与醇反应的光染料,该染料在受体展开时与暴露的囊蛋白结合.
- 采用了一个热稳定变体,tsNLuc,以扩大试验的温度范围和灵敏度.
主要成果:
- 热BRET准确地报告GPCR展开,并确定未净化,溶解膜制剂和整个细胞的点 (Tm).
- 在各种条件下证明了大麻素受体 (CB1,CB2) 和β2-上腺受体的差异性热稳定性.
- 与野生型Nluc.相比,展示了tsNLuc变体的增强性能,其Tm明显高于野生型Nluc.
结论:
- 热BRET是一种多功能且高效的方法,用于评估GPCR的热稳定性.
- 该试验适用于未净化的蛋白质,不需要标记的配体,扩大其实用性.
- ThermoBRET促进了药物发现查,并有助于优化膜蛋白净化条件.
