在Clostridium acetobutylicum中基于5FC/5FU对抗选择的基因组编辑工具的改进

科学领域:

• 微生物学和基因工程 基因工程
• 克洛斯特里迪亚的代谢工程

背景情况:

• 在*Clostridium acetobutylicum*中确立的基因组工程方法依赖于5 - 甲 (5FU) 或5 - 细胞素 (5FC) 的抗性进行选择.
• 一个以前开发的系统使用了自杀等离子体 (pCat-upp) 和通过*upp*基因进行反选择,用于无标记基因组编辑.
• 5FU的突变性导致5FU耐药突变的出现,破坏了选择过程.

研究的目的:

• 解决C. acetobutylicum*基因组编辑过程中遇到的5FU耐药性问题.
• 为可靠的基因组修改开发改进和预防策略.
• 优化pCat-upp/5FU系统以提高效率和降低变异性.

主要方法:

• 确定了 *pyrR* 基因 (PyrR A115) 的突变是 *CAB1060* 菌株中 5FU 耐药性的原因.
• 开发了一种表达野生类型*pyrR*基因的校正等离子体,以恢复5FU敏感性.
• 构建了一个预防性自杀等离子体 (pCat-upp-pyrR*) 与一个合成的,编码器优化的 *pyrR* 基因 (*pyrR*),以最大限度地减少同质性和防止抗性.
• 优化了pCat-upp/5FU系统,将5FU度降低到5μM在定义的合成介质中.

主要成果:

• 校正等离子体成功地恢复了耐药*CAB1060*菌株的5FU敏感性.
• 预防性等离子体pCat-upp-pyrR*是为了避免未来的耐药性问题而开发的.
• 优化的系统和降低的5FU度最大限度地降低了突变致病效应.
• 成功地用*sadh-hydG*运替换了*ldh*基因,使得乙转化为异醇.

结论:

• 这项研究提出了强有力的解决方案,以克服C. acetobutylicum*基因组工程中的5FU耐药性.
• 开发的等离子体和优化的条件提高了基因改造的可靠性和安全性.
• 成功的基因替代证明了改进系统对代谢工程应用的实用性,例如异醇生产.