改善了来自SARS-CoV-2的高活性3 chymotrypsin-like蛋白酶的表达和净化
Hong-Loan T Nguyen1, Nhu-Quynh T Nguyen2, The-Thai Le2
1Key Laboratory of Enzyme and Protein Technology, VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Thanh Xuan, Hanoi, Viet Nam; Faculty of Biology, VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Thanh Xuan, Hanoi, Viet Nam.
Protein expression and purification
|December 10, 2023
概括
研究人员设计了一种真实的SARS-CoV-2 3CLpro酶 (au3CLpro),与商业版本相比,其活性和催化效率显著提高. 这种改进的蛋白酶是COVID-19治疗开发的有希望的目标.
科学领域:
- 生物化学 生化学
- 病毒学 病毒学
- 药物发现 药物发现 药物发现
背景情况:
- 由SARS-CoV-2引起的COVID-19大流行需要采取有效的控制措施.
- 在SARS-CoV-2 3基米素样蛋白酶 (3CLpro),也称为Mpro,对于病毒复制和组装至关重要.
- 3CLpro是开发针对SARS-CoV-2的抗病毒疗法的有希望的目标.
研究的目的:
- 为了设计和表达一个真实的N端SARS-CoV-2 3CLpro (au3CLpro) 具有增强的酶特性.
- 为了比较工程 au3CLpro 的活性和催化效率与商用 3CLpro (com3CLpro).
主要方法:
- 修改了pETM33-Nsp5-Mpro矢量,通过插入一个自动切割位点和一个His-tag.
- 使用单步亲和染色法来表达和净化au3CLpro.
- 在最佳条件下进行酶分析以确定特定活性和催化效率 (Kcat/Km).
主要成果:
- 与com3CLpro (889 RFU/min/μg) 相比,工程 au3CLpro 的特异性活性显著更高 (3169 RFU/min/μg).
- 与com3CLpro (Kcat/Km = 0.0015 μM-1.s-1) 相比,au3CLpro的催化效率增加了4.6倍 (Kcat/Km = 0.007 μM-1.s-1),而 com3CLpro的催化效率则增加了0.0015 μM-1.s-1.
- 对au3CLpro的最佳活性是在50毫米的Tris-HCl缓冲剂 (pH7) 中与150毫米的NaCl和0.1毫克/毫升的BSA在37°C时实现的.
结论:
- 与商业酶相比,工程 au3CLpro 具有更高的酶活性和催化效率.
- 这种增强的蛋白酶代表了SARS-CoV-2研究和潜在的治疗开发的更有效的工具.
- 优化的表达和净化策略提供了一种强大的方法来获得高度活性3CLpro.
