外源的spike-in小鼠RNA用于精确的差异基因表达分析在大麦使用RT-qPCR
Marcus A Vinje1, David A Friedman1
1USDA, Agricultural Research Service, Cereal Crops Research Unit, Madison, WI 53726, United States.
Biology methods & protocols
|December 20, 2023
概括
这项研究引入了外部参考基因,以便在大麦造中更准确地进行基因表达分析. 与传统的内部参考基因相比,这种方法显著降低了变异性,并提高了转录水平测量的可靠性.
科学领域:
- 分子生物学分子生物学
- 植物科学 植物科学
- 生物技术是生物技术.
背景情况:
- 精确的基因表达测量依赖于验证的参考基因,用于RT-qPCR测定中的正常化.
- 通常使用的内部参考基因 (管家基因) 往往没有得到验证,导致结果的变化.
- 之前使用大麦酒的内部参考基因的研究表明,大麦酒的变异性很大.
研究的目的:
- 开发和验证一种用于基因表达分析的新方法,可以规避对内部参考基因的需求.
- 识别和验证稳定表达的外部参考基因,以使大麦的基因表达数据正常化.
- 在大麦酒和谷物发展研究中,比较外部与内部参考基因的准确性和可靠性.
主要方法:
- 共同放大小鼠总RNA (作为外部参考入) 和大麦RNA以创建cDNA.
- 创建用于假定稳定的小鼠基因的原始组,以确定合适的外部参考基因.
- 使用验证的外部参考基因对大麦基因表达数据的规范化和与内部参考基因规范化进行比较.
主要成果:
- 用外部参考基因进行正常化显著减少了标准偏差,并揭示了显著的转录丰度差异.
- 内部参考基因导致较大的标准偏差,并未检测到显著差异.
- 与内部参考基因相比,外部参考基因在麦芽和发育谷物中提供了更准确的表达水平评估.
结论:
- 外部参考基因提供了一种更可靠,更准确的方法来规范大麦的基因表达数据,特别是在麦芽和谷物开发过程中.
- 使用验证的外部参考基因克服了与传统的内部参考基因相关的局限性和变异性.
- 这种方法提高了植物分子生物学研究中转录水平测量的精度.
