制作CRISPR-Cas9转基因细胞系用于侧向研究
Michael Wagenbach1, Juan Jesus Vicente1, Wren Wagenbach2
1Department of Physiology & Biophysics, University of Washington School of Medicine, Seattle, Washington.
Current protocols
|December 28, 2023
概括
研究人员可以通过使用拉巴胺素诱导的二分化和CRISPR技术,设计细胞来控制蛋白质的位置. 这种方法允许从内源性促进体表达的蛋白质的快速空间重新定位,使新的细胞发现成为可能.
科学领域:
- 细胞生物学 细胞生物学
- 分子生物学分子生物学
- 遗传学 是一个遗传学.
背景情况:
- 蛋白质功能受到细胞局部化的严格调节.
- 精确控制蛋白质位置对于理解细胞过程至关重要.
- 现有的蛋白质重新定位方法可能是繁的或缺乏内源性表达.
研究的目的:
- 为工程细胞提供一个简单的协议,具有可空间控制的内源性蛋白质.
- 通过使用拉帕素诱导的二分化来实现蛋白质的快速重新定位.
- 适应CRISPR技术,用于精确的基因修饰和蛋白质标记.
主要方法:
- 利用CRISPR技术在内生位置进行向基因编辑.
- 工程蛋白质与拉巴胺素可诱导的二分化域用于空间控制.
- 采用分割-GFP构造来识别最佳目标站点并最大限度地减少目标外影响.
- 描述基因修饰,细胞转移和验证的详细协议.
主要成果:
- 成功的细胞工程与拉巴素可重新定位的内源性蛋白质.
- 通过分割GFP查来最小化非目标效应的证明.
- 使用微管脱聚合器MCAK/Kif2C. 验证该协议的有效性.
- 通过空间控制的内源性蛋白质水平实现的新发现的例子.
结论:
- 该协议提供了一种可靠且易于使用的方法,用于创建具有空间调节的内源蛋白质的工程细胞.
- 该技术可以适应各种蛋白质和实验修改,超出了本例的范围.
- 它使研究人员,即使是那些基本的光显微镜访问,通过精确的空间控制调查蛋白质功能.
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