活细胞成像内源性CSB-mScarletI作为DNA损伤诱导的转录应激的敏感标志物

科学领域:

• 分子生物学分子生物学
• 细胞生物学 细胞生物学
• 遗传学 遗传学 是一个

背景情况:

• 通过RNA聚合酶II (RNA Pol II) 的转录对细胞功能至关重要,但受到DNA损伤的阻碍.
• 量化转录阻断DNA病变 (TBLs) 和它们在活细胞中的修复存在重大挑战.

研究的目的:

• 开发一种用于敏感检测和定量TBL及其实时修复在活细胞中的新方法.
• 为了研究可凯恩综合征组B蛋白 (CSB) 和UV刺激的支架蛋白A (UVSSA) 对DNA损伤的反应的动态.

主要方法:

• 使用CRISPR-Cas9基因编辑,创建表达mScarletI标记的CSB和UVSSA的诺金细胞.
• 在光漂白后的光恢复 (FRAP) 用于研究CSB和UVSSA与损伤停滞的RNA Pol II的结合动态.
• 流细胞测量被用来分析CSB蛋白水平调节通过ubiquitylation和deubiquitylation.

主要成果:

• 认定CSB移动性是在生理上相关的DNA损伤水平上转录压力的敏感标志物.
• 随着时间的推移,CSB的固定有效地评估了转录合核酸切除修复 (TC-NER) 介导的修复.
• 通过CRL4^CSA介导的无处不在和USP7介导的二位无处不在被证明可以调节CSB蛋白水平.

结论:

• 开发的方法可以灵敏地检测TBL,并监测它们在活细胞中的修复.
• 这种方法有助于研究TC-NER复杂组合和稳定性的研究.
• CSB的移动性是转录压力和修复动态的强有力的指标.