纳米孔测序改进了基于CRISPR定制的基因激活库的构建
Handing Wang1,2, Heng Yih Tan2, Jiazhang Lian1,3
1Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education, College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou, China.
Biotechnology and bioengineering
|January 31, 2024
概括
这项研究引入了一种快速的纳米孔测序方法,用于评估用于酵母基因编辑的CRISPR指导RNA (gRNA) 池. 这提高了Saccharomyces cerevisiae中的基因和代谢工程的效率.
科学领域:
- 分子生物学分子生物学
- 遗传学 是一个遗传学.
- 生物技术是生物技术.
背景情况:
- 克里斯普尔查对于识别细胞表型的基因标至关重要.
- 导向RNA (gRNA) 池建设方法如金门和吉布森组装缺乏系统的比较和高效的质量控制.
- 目前对gRNA库的质量检查是耗时的.
研究的目的:
- 建立和验证内部纳米孔测序工作流程,以评估gRNA池构建方法.
- 为了减少gRNA池构建中的偏差,使用聚合酶介导的非放大方法.
- 确定最佳的基因激活工具和gRNAs用于Saccharomyces cerevisiae中的CRISPR激活,并选以改善乙醇利用.
主要方法:
- 开发一个内部纳米孔测序工作流程用于gRNA池质量评估.
- 利用聚合酶介导的非放大方法来最大限度地降低池施工偏差.
- 在Saccharomyces cerevisiae中使用dCas12a进行CRISPRa选,以表征激活域并优化gRNAs.
- 设计和选一个定制的gRNA池,针对中央代谢途径,以提高乙醇利用率.
主要成果:
- 纳米孔测序工作流提供了一种具有成本效益和快速的方法来评估gRNA库质量.
- 确定了基于dCas12a的激活基因的更强激活域 (MED2,HAP4) 和优质gRNA.
- 成功选定制gRNA库,以识别S. cerevisiae中改善乙醇利用的基因标.
- 在使用非放大方法的gRNA池构造中证明了减少偏差.
结论:
- 开发的纳米孔测序工作流程显著提高了gRNA库质量控制的速度和效率.
- 这种方法促进了Saccharomyces cerevisiae中更快,更有效的基因和代谢工程.
- 这项研究为优化基于CRISPR的查和工程应用提供了宝贵的工具.
