一个有效的表达和净化协议为SpCas9核酶和评估不同输送方法的核蛋白

科学领域:

• 分子生物学分子生物学
• 基因编辑技术的技术

背景情况:

• 集群定期间隔的短时间的Palindromic重复 (CRISPR) -Cas9系统使精确的基因组编辑成为可能.
• 核蛋白质 (RNP),包括Cas9蛋白和导向RNA (gRNA),增强特异性,并最大限度地减少目标外突变.
• 对CRISPR-Cas9的等离子体DNA引入可能导致意外的外来DNA集成.

研究的目的:

• 开发一种高效的方法来制备复合性Streptococcus pyogenesCas9 (SpCas9) 蛋白质.
• 将CRISPR-Cas9通过等离子体DNA传递的效率与RNP复合体进行比较.
• 评估RNP交付对基因组编辑效率和蛋白质寿命的影响.

主要方法:

• 使用小型基素类似修饰剂 (SUMO) 标签系统进行重组SpCas9蛋白净化,涉及金属亲和和离子交换染色学.
• 通过等离子体DNA转染和RNP复合体转染传递CRISPR-Cas9的细胞传递.
• 基因组编辑率的量化和Cas9蛋白质在传染后的稳定性.

主要成果:

• 为净化重组SpCas9蛋白建立了一个高效和简单的协议.
• 与等离子体DNA相比,RNP交付证明了高效的基因组编辑和减少非目标效应.
• 单独使用RNP治疗,没有转染剂,被证明是一种有效的输送方法,降低了细胞毒性.

结论:

• SUMO-tag系统提供了一种可扩展的方法,用于生产高纯度的SpCas9蛋白.
• 基于RNP的CRISPR-Cas9传递在特异性和安全性方面优于基于等离子体的方法.
• 直接RNP治疗为像iPSC这样的敏感细胞类型的基因组编辑提供了一个有希望的低细胞毒性方法.