来自小麦的phenylalanyl-tRNA合成酶的重组表达和净化:一种长期存在的多 (U) 依存的多 (Phe) 合成系统
Haruyuki Furukawa1, Yuto Nagashio1, Kensuke Tsutsumi1
1Department of Materials Sciences and Biotechnology and Department of Applied Chemistry, Graduate School of Science and Engineering, Ehime University, Matsuyama, Ehime, Japan.
Preparative biochemistry & biotechnology
|March 5, 2024
概括
在大肠杆菌中,小麦氨-tRNA合成酶 (PheRS) 子单元被共同表达,产生一种可溶性,活性四重体复合物. 这种重组的PheRS表现出比本地小麦胚芽PheRS.更高的特异活性.
科学领域:
- 分子生物学分子生物学
- 蛋白质生物化学 蛋白质生物化学
- 酶学 是一种酶学.
背景情况:
- 氨-tRNA合成酶 (PheRS) 对于蛋白质合成至关重要,它催化了tRNA^Phe.的氨基化.
- 了解植物PheRS的结构功能关系需要高效的重组表达系统.
- 小麦PheRS包括α和β子单元,它们的异质表达提出了挑战.
研究的目的:
- 开发一种方法,用于Escherichia coli中功能小麦氨基-tRNA合成酶 (PheRS) 的复合表达和净化.
- 为了描述再组合小麦PheRS的活性.
- 在体外蛋白质合成系统中评估再组合小麦PheRS的功能.
主要方法:
- 小麦PheRSα和β子单元基因被合成并克隆为大肠杆菌的表达载体.
- 进行了两个子单元的联合表达,随后使用亲和色谱和凝过进行了净化.
- 进行了His-tag的切割和分单元静脉测量评估.
- 进行了酶活性测定和多 (U) 依存多 (Phe) 合成反应.
主要成果:
- 在大肠杆菌中小麦PheRSα和β子单元的联合表达产生了可溶性,功能复合体.
- 净化导致了四重体 (α2β2) 复合物,其大约产量为0.6 mg/L.
- 重组小麦PheRS (28nmolmin-1mg-1) 的特异活性高于原生小麦胚芽PheRS.
- 再组合PheRS支持了与小麦胚芽延长因子和核糖体结合的多依赖的多合成.
结论:
- 在大肠杆菌中,小麦PheRS子单元的异质共同表达是产生功能性酶的可行策略.
- 重组小麦PheRS表现出强大的酶活性,适用于体外翻译研究.
- 这项工作为进一步研究植物氨基酸-tRNA合成酶和蛋白质合成提供了宝贵的工具.
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