高通量测定利用混乱到顺序的形态开关:适用于蛋白质体Rpn10:E6AP复合体
Christine S Muli1, Sergey G Tarasov2, Kylie J Walters1
1Protein Processing Section, Center for Structural Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health Frederick MD 21702 USA kylie.walters@nih.gov.
Chemical science
|March 15, 2024
概括
我们开发了一种新的光试验,以追踪蛋白质构造变化,特别是由E3酶E6AP诱导的Rpn10 AZUL结合域 (RAZUL) 中的障碍到顺序切换. 这种方法使得破坏性连接体的高通量选成为可能.
科学领域:
- 生物化学 生物化学
- 分子生物学分子生物学
- 结构生物学 结构生物学
背景情况:
- 蛋白质相互作用经常驱动构造性切换,特别是在内在无序的蛋白质中.
- 众所周知,E3酶E6AP的AZUL域在蛋白质体Rpn10AZUL结合域 (RAZUL) 中诱导疾病到秩序的过渡.
研究的目的:
- 开发一种双直角的,基于光的测定方法,用于监测蛋白质结构转换事件.
- 应用此试验用于破坏Rpn10:E6AP相互作用的配体的高通量选.
主要方法:
- 利用对环境敏感的光剂 (acrylodan和Atto610) 在RAZUL上标记不同的位置.
- 开发了一种双重标记策略,将两种光体在单个样本中结合在一起.
- 测量了对E6AP结合的直角光谱反应,以量化形状变化.
主要成果:
- 在RAZUL上确定了对acrylodan和Atto610的最佳标签位置,对E6AP有明显的光谱反应.
- 在E6AP结合时观察到低色变化和增加光与acrylodan-RAZUL,以及降低光与Atto610-RAZUL.
- 通过使用双标记测试,证明了E6AP诱导的混乱到秩序切换的稳健和直角测量.
结论:
- 开发的试验有效监测RAZUL.RAZUL中E6AP诱导的形状变化.
- 这种双光方法适合对Rpn10:E6AP破坏性连接体进行高通量选.
- 该方法广泛适用于研究其他分子相互作用中的混乱到秩序过渡.
