优化了SARS-CoV-2聚合酶复合物的重组表达和净化
Ana Podadera1, Lucas Campo1, Fasih Rehman1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Windsor, Windsor, Ontario, Canada.
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|March 21, 2024
概括
一种新方法有效地表达和净化了活跃的SARS-CoV-2RNA依赖RNA聚合酶 (RdRP) 复合体. 这种可靠的协议可以产生核心RdRP的毫克量,用于关键的结构,功能和抑制研究.
科学领域:
- 病毒学 病毒学
- 分子生物学分子生物学
- 生物化学 生物化学
背景情况:
- 严重急性呼吸道综合征冠状病毒-2 (SARS-CoV-2) 的RNA依赖RNA聚合酶 (RdRP) 对于病毒复制至关重要.
- 由于蛋白质折叠和复杂组合,活跃的SARS-CoV-2 RdRP复合体 (nsp7,nsp8和nsp12) 的表达和净化存在重大挑战.
- 以前的方法在为详细研究提供足够数量的活性RdRP方面存在局限性.
研究的目的:
- 开发一个优化和可靠的协议来表达和净化活跃的SARS-CoV-2核心RdRP复合体.
- 为进一步研究提供酶活性聚合酶复合物的毫克量的一致来源.
- 为了促进SARS-CoV-2 RdRP的结构,功能和抑制研究.
主要方法:
- 调整了一种已发表的方法,用于表达大肠杆菌中核心SARS-CoV-2 RdRP复合物的表达.
- 纳入了一种表达昆虫细胞中与马尔托结合蛋白融合的nsp12的过程,以增强复杂的组装.
- 利用亲和度标签去除后净化,以获得具有定义的固基度的活性核心聚合酶复合体.
主要成果:
- 成功开发了一种协议,产生了活性SARS-CoV-2核心RdRP复合物的毫克量.
- 在净化复合体中,为nsp7,nsp8和nsp12实现了预期的1:2:1静脉测量.
- 该协议提供了一个可靠的平台,克服了以前方法的局限性.
结论:
- 优化的协议提供了一种可靠的方法来产生SARS-CoV-2 RdRP复合体.
- 这种可靠的活性聚合酶复合物的来源对于推动SARS-CoV-2结构,功能和抗病毒药物开发的研究至关重要.
- 再组合等离子体结构通过Addgene可用,促进科学界的可访问性.
