一个没有PAM的一步不对称的RPA和CRISPR/Cas12b组合试验 (OAR-CRISPR) 用于快速和超敏感的DNA检测
Lei Yang1, Guanwei Chen1,2, Jian Wu3
1State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-Products, Key Laboratory of Traceability for Agricultural Genetically Modified Organisms, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, P.R.China, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China.
Analytical chemistry
|March 29, 2024
概括
一种新的单步测定方法,OAR-CRISPR,将不对称的重组酶聚合酶放大 (RPA) 与CRISPR/Cas12b相结合,用于快速,敏感的DNA检测. 这种没有PAM的方法简化了诊断,并使低DNA度的肉眼识别成为可能.
科学领域:
- 分子诊断学 分子诊断学
- 在CRISPR-Cas系统中.
- 核酸放大核酸放大 核酸放大
背景情况:
- 目前的分子诊断通常将异热放大与CRISPR/Cas系统相结合,以提高灵敏度.
- 现有的两步测定方法复杂且容易受到污染.
- 一步测试面临的挑战是由于固有的不兼容性和对Cas12激活的原体空间相邻动机 (PAM) 的要求.
研究的目的:
- 开发一种基于CRISPR/Cas12b的DNA检测的新型,无PAM,单步测定.
- 克服现有方法的局限性,包括PAM站点依赖性和多步骤程序.
- 提高分子诊断方法的速度,简单性和灵敏性.
主要方法:
- 开发了一步非对称的重组酶聚合酶放大 (RPA) 与CRISPR/Cas12b试验 (OAR-CRISPR) 相结合.
- 不对称的RPA产生单链DNA (ssDNA) 用于CRISPRRNA结合,绕过了PAM站点的要求.
- 在不干扰RPA放大的情况下,通过无PAMcrRNA集成ssDNA裂变.
主要成果:
- 在四分之一的时间内,OAR-CRISPR试验达到与定量PCR (qPCR) 相比的灵敏度.
- 在8分钟内可以用肉眼检测到仅60个DNA拷贝/μL的DNA.
- 成功将不对称的RPA集成到基于CRISPR的一步检测系统中.
结论:
- 在基于CRISPR/Cas12b的一步检测方面,OAR-CRISPR代表了显著的进步.
- 没有PAM的单步方法简化了操作,降低了污染风险.
- 这种方法扩大了基于CRISPR的检测适用于各种DNA点的应用范围.
