通过ARS等离子体和基于碳源的选择来实现Komagataella phaffii可扩展的蛋白质生产

科学领域:

• 生物技术是生物技术.
• 分子生物学分子生物学
• 微生物工程 微生物工程

背景情况:

• 基因组集成是Komagataella phaffii (Pichia pastoris) 蛋白质生产的标准,但受到克隆变异性的影响,限制了高通量应用.
• 在K. phaffii中,外染色体附带性等离子体是不稳定的,需要持续的选择压力,这种压力很难扩展.
• 现有的选择方法 (抗生素耐药性,辅食性) 不适合可扩展的生产过程.

研究的目的:

• 建立和评估一种用于K. phaffii的重组蛋白质生产的新系统,使用异染色体自主复制序列 (ARS) 质粒.
• 研究使用关键的糖代谢基因 (糖激酶1 [GUT1]和三酸盐异构酶1 [TPI1]) 作为无抗生素选择标记物用于插曲性等离子体维护.
• 开发适合实验室规模生物反应器应用的可扩展的,不依赖甲醇的生产系统.

主要方法:

• 在K. phaffii.中使用GUT1和TPI1作为选择标记物的ARS等离子体的开发.
• 使用Ashbya gossypii转录延长因子1 (TEF1) 促进体的标记基因表达的优化.
• 在微尺度深井板,震动瓶和5L生物反应堆中评估转化效率和记者蛋白 (CalB) 生产.

主要成果:

• 具有TEF1促进体的ARS等离子体对GUT1和TPI1标记系统表现出高的转换效率和卓越的性能.
• 与摇瓶培养中的参考综合菌株相比,GUT1标记菌株的CalB产量增加了46%.
• 在5L生物反应器培养中,带有GUT1标记物的环体系统导致了与集成结构相比,超级生物中的CalB活性增加100%.

结论:

• 首次成功地证明了K. phaffii蛋白质生产的可扩展,甲醇独立的环体表达系统.
• A. gossypii TEF1促进体有效地驱动ARS等离子体中GUT1选择标记物的表达.
• TPI1标记系统扩大了K. phaffii的无抗生素标记选项,适用于分期和整合表达.