活细胞成像揭示了Cas9和Cas12a的目标搜索灵活性和效率之间的权衡
Lorenzo Olivi1, Cleo Bagchus1,2, Victor Pool1,2
1Laboratory of Microbiology, Wageningen University & Research, Wageningen, The Netherlands.
Nucleic acids research
|April 22, 2024
概括
研究了CRISPR-Cas基因组编辑核酶SpyCas9和LbCas12a的DNA目标搜索效率. 与SpyCas9变体相比,LbCas12a变体表现出更快,更有效的DNA向,特别是当PAM要求放松时.
科学领域:
- 分子生物学分子生物学
- 遗传学 遗传学 是一个
- 生物技术是生物技术.
背景情况:
- 克里斯普尔-卡斯系统是使用卡斯核酶 (如SpyCas9和LbCas12a) 的基因组编辑工具.
- 这些核酶在PAM识别,指导结构和DNA裂变机制上有所不同.
- 工程变体,SpRYCas9和impLbCas12a,通过放松PAM约束来扩大DNA准范围.
研究的目的:
- 量化蛋白质特征对CRISPR-Cas核酶的DNA标搜索动力学的影响.
- 为了比较野生类型和工程化SpyCas9和LbCas12a变体之间的DNA搜索效率.
- 建立分析其他核酶中DNA目标搜索动态的框架.
主要方法:
- 利用dCas9和dCas12a的催化无活性变体与PAmCherry2.1融合,用于Escherichia coli中的单颗粒追踪.
- 进行单颗粒追踪实验,以获得DNA目标查询的动力参数.
- 使用模拟和活细胞成像来验证目标搜索效率的发现.
主要成果:
- 动力分析显示,当使用非向RNA导向器时,LbCas12a变体比SpyCas9变体更快地审讯DNA.
- 在特定的目标DNA位点的存在下,与SpyCas9变体相比,LbCas12a变体在目标获取方面表现出更高的速度和效率.
- 该研究量化了与SpyCas9和LbCas12a系统中放宽PAM要求相关的权衡.
结论:
- 与SpyCas9.9相比,LbCas12a核酶在DNA目标搜索速度和效率方面具有固有的优势.
- 在工程变异中放松PAM特异性会影响DNA搜索动态,在目标可访问性和搜索动态之间进行权衡.
- 开发的单粒子跟踪框架为量化各种核酶中的DNA搜索过程提供了一种多功能方法.
