通过CRISPR-Cas9加速基因组编辑
Amy R Eggers1, Kai Chen1, Katarzyna M Soczek2
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, Berkeley, CA 94720, USA; Innovative Genomics Institute, University of California, Berkeley, Berkeley, CA 94720, USA.
工程化Geobacillus stearothermophilus Cas9 (GeoCas9) 在其形域中的突变显著提高了人类细胞中的基因组编辑. 这种改进源于加速DNA解,为改进CRISPR-Cas9技术提供了新的策略.
科学领域:
- 分子生物学
- 生物技术
- 遗传学
背景情况:
- 由于蛋白质的稳定性较长,热稳定的CRISPR相关 (Cas9) 酶提供了增强基因组编辑的潜力.
- 在人类细胞中,Geobacillus stearothermophilus Cas9 (GeoCas9) 酶的活性有限,阻碍了其应用.
- 形 (WED) 域中的突变是克服Cas9正位数局限性的关键.
研究的目的:
- 研究实验室进化GeoCas9变种增强基因组编辑活动背后的机制.
- 阐明WED领域在GeoCas9活动中的结构和功能作用.
- 建立改善其他Cas9基因组编辑的总体策略.
主要方法:
- 实验室进化GeoCas9以增强其在人体细胞中的活性.
- 低温电子显微镜 (cryo-EM) 来确定野生类型和改进的GeoCas9 (iGeoCas9) 的结构.
- 在不同的条件下分析DNA解动力学和基质捕获的生物化学测试.
主要成果:
- 与野生类型酶相比,实验室开发的GeoCas9 (iGeoCas9) 的基因组编辑水平高出100倍.
- 冷电磁结构显示了iGeoCas9 WED域与DNA基板之间的扩展接触.
- iGeoCas9显示了加速的DNA解,在限制的哺乳动物细胞条件下促进基质捕获.
结论:
- Cas9 WED域在DNA解中起着至关重要的作用,这对于高效的基因组编辑至关重要.
- 加快目标DNA解是显著改善Cas9诱导基因组编辑活动的关键因素.
- 这项研究提供了一个可通用的策略,用于设计其他Cas9基因组编辑器,以提高它们的基因组编辑能力.
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