使用高通量FACS查来识别缺乏正规二次结构的功能性sgRNA突变
Zeyu Liang1, Chaoyong Huang1, Yan Xia1
1Key Laboratory of Molecular Medicine and Biotherapy, Aerospace Center Hospital, School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China.
Cell reports
|June 1, 2024
概括
研究人员开发了新的单向导RNA (sgRNA) 突变,使稳定的CRISPR基因编辑成为可能. 这些非正规的sgRNA保持了Cas9活性,克服了微生物多重工程的遗传不稳定性.
科学领域:
- 合成生物学 合成生物学
- 分子生物学分子生物学
- 生物技术是生物技术.
背景情况:
- 在CRISPR系统中共同表达相同的单向导RNA (sgRNA) 会导致遗传不稳定性和表型丧失.
- 现有的sgRNA设计限制了多重基因工程的效率.
研究的目的:
- 为高效的DNA消化和稳定的多重基因工程开发功能性sgRNA衍生物.
- 为了研究在Cas9复合体内sgRNAs的结构灵活性.
主要方法:
- 设计了一个高通量消化活动依赖的阳性查策略.
- 产生并表征了具有广泛突变的非重复性sgRNA突变.
- 使用这些突变体在体内验证了Cas9-sgRNA复杂活性.
- 采用基于生物传感器的光激活细胞分类 (FACS) 进行菌株识别.
主要成果:
- 获得了多达48/61个突变核酸的功能性非重复性sgRNA突变,缺乏正规的二次结构.
- Cas9-sgRNA复合体与非正规的sgRNAs在体内保留了野生类型的DNA消化活性.
- 在微生物细胞工厂中成功实现了多重基因淘汰和基因编辑.
- 建立了代谢工程图书馆,并确定了异butanol 和 1,3-propanediol 的过度生产者.
结论:
- 证明了功能性sgRNAs表现出显著的二次结构灵活性.
- 开发了一种新型sgRNA类,使微生物平台的稳定和高效的多重基因组工程成为可能.
- 这一突破为生物燃料和化学生产提供了先进的代谢工程.
