在Saccharomyces cerevisiae中进行高效的基因组编辑的双双auxotrophy合红色标签策略
Jianhua Li1, Taorui Wu1, Jialong Wang1
1College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, People's Republic of China.
Fungal genetics and biology : FG & B
|June 19, 2024
概括
在酵母菌中,同源重组和CRISPR/Cas9基因编辑策略经常产生混合克隆. 一个新的双标记系统有效地选纯淘汰克隆,解决了酵母和真菌基因编辑的一个关键挑战.
科学领域:
- 分子生物学分子生物学
- 酵母遗传学 酵母遗传学
- 基因编辑技术的技术
背景情况:
- 同源重组 (HR) 和CRISPR/Cas9是编辑Saccharomyces cerevisiae基因的已知方法.
- 以前的研究表明,S. cerevisiae中的基因编辑很简单,但克隆纯度的挑战仍然存在.
- 当BY4742菌株在ade2中出现缺陷时,在YPD板上呈现红色表型,提供视觉标记.
研究的目的:
- 系统地分析HR,CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas9-HDR策略的效率和局限性,以消除BY4742.2.中的ade2基因.
- 开发一种改进的酵母基因编辑策略,克服选纯淘汰克隆的挑战.
- 为了提供一个新的基因淘汰在宏的单细胞菌的基因淘汰的参考.
主要方法:
- 对同源重组 (HR),CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas9-HDR策略进行对BY4742的ade2基因淘汰进行比较分析.
- 开发一种新的策略,将CRISPR/Cas9与含有ade2表达盒的同质介导修复模板结合起来.
- 利用BY4742的红色表型 ((ade2Δ0) 进行查和验证基因淘汰,包括trp1.1.
主要成果:
- 人力资源战略导致了高百分比的非目标突变和异质克隆 (10% -80%).
- 克里斯普尔/卡斯9策略导致60%的克隆脱而出,其余部分是异质克隆.
- 虽然CRISPR/Cas9-HDR策略在大多数细胞中取得了成功的编辑,但至少在60%的克隆中仍然产生异质克隆.
- 新的双标记器策略实现了对trp1的100%淘汰效率,证明了对纯克隆的有效查.
结论:
- 异质克隆的出现是使用当前标准策略编辑BY4742 ade2位点的一个固有的挑战.
- 已经建立了一个新的有效的酵母基因淘汰策略,将CRISPR/Cas9与双重auxotrophy和红色标记相结合.
- 这项研究提供了一个有效选纯淘汰克隆的解决方案,并为真菌基因编辑提供了宝贵的参考.
