相关实验视频
Updated: Jun 21, 2025
08:38
Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts
Published on: June 23, 2023
2.7K
优化原生细胞隔离和转染与一个断点:加快Cas9/sgRNA裂变效率验证在单和双
Debasmita Panda1,2, Subhasis Karmakar1, Manaswini Dash1
1ICAR National Rice Research Institute, Cuttack, Odisha 753006 India.
aBIOTECH
|July 8, 2024
概括
这项研究提出了一种新的,快速的CRISPR-Cas9协议,用于验证植物单向导RNA (sgRNA) 的效率. 该方法使用优化的原生质隔离和转染,以便在稳定转化之前快速评估.
科学领域:
- 分子生物学分子生物学
- 植物生物技术 植物生物技术
- 基因组编辑 基因组编辑
背景情况:
- 克里斯普尔-卡斯基因组编辑工具提供了精确性,但软件预测的指导RNA (gRNA) 通常表现出低效率.
- 由于复杂的染色质结构,目标部位的可访问性是基因组编辑的一个主要挑战.
- 目前评估gRNA效率的方法耗时或缺乏本地基因组背景.
研究的目的:
- 开发一种高效的协议,用于对大米,阿拉比多普西斯和小的原始细胞隔离和转染.
- 为了快速验证CRISPR-Cas9.9单向导RNA (sgRNA) 裂变效率,我们将使用CRISPR-Cas9.
- 为了减少对低效的基因组编辑实验所花费的时间和资源.
主要方法:
- 使用糖糖梯度优化原生质隔离.
- 高效聚乙烯甘醇 (PEG) 介导的原生质的转化.
- 使用sgRNA针对特定基因的等离子体载体进行CRISPR-Cas9传递.
- 通过双 sgRNA 和 agarose 凝电泳检测基因组编辑.
- 使用桑格序列的编辑效率的验证.
主要成果:
- 在单 (大米) 和双 (阿拉比多普西斯,小) 原塑体中实现了高的转染效率.
- 通过使用双 sgRNAs 的 CRISPR 删除策略,证明了对基因组编辑成功的直接检测.
- 证实,孤立的原生质可以存储24-48小时,生命力损失最小.
结论:
- 开发的协议可以快速 (不到7天) 验证sgRNA裂变效率.
- 这种方法有助于在进行稳定转换之前有效评估基因组编辑.
- 该协议适用于各种应用,包括验证编辑策略,评估试剂和植物再生.
