建立可诱导CRISPRd系统的议定书,用于阻断人类多能干细胞中的转录因子结合位
Satoshi Matsui1, Joseph R Shiley1, Morgan Buckley1
1Division of Developmental Biology, Center for Stem Cell & Organoid Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Cincinnati, Department of Pediatrics, College of Medicine, University of Cincinnati, Cincinnati, OH 45229, USA.
STAR protocols
|August 12, 2024
概括
这项研究引入了一种新方法,使用在人类多能干细胞 (hPSCs) 中使用可诱导多西环素的CRISPR干扰 (CRISPRi) 来精确地阻止转录因子 (TF) 结合. 这使得研究人员能够从复杂的二次基因调节变化中区分直接的TF效应.
科学领域:
- 分子生物学分子生物学
- 干细胞生物学 干细胞生物学
- 基因法规 基因法规
背景情况:
- 转录因子 (TF) 基因淘汰/淘汰揭示了基因调节的下游影响.
- 区分主要的直接TF效应和次要效应是一项挑战.
- 克里斯普尔干扰 (CRISPRi) 提供了一种专门阻止TF结合的方法.
研究的目的:
- 开发一个评估直接TF约束事件的协议.
- 在人类多能干细胞 (hPSCs) 中建立可诱导多キシ环素 (Dox) 的CRISPRi系统.
- 为了能够精确分析TF对基因调节的直接影响.
主要方法:
- 在hPSC中建立了一种可诱导多克西环素 (Dox) 的CRISPRi系统.
- 设计和准备的单导向RNA (sgRNA) 晶状病毒载体.
- 生成的CRISPRi hPSCs与sgRNAs进行转换.
- 分析了使用染色体免疫沉 (ChIP) -qPCR的CRISPRiTF阻断效应.
主要成果:
- 在hPSC中成功建立了一个功能Dox诱导的CRISPRi系统.
- 证明有能力专门阻止TF约束事件.
- 实现了直接TF介导基因调节的分析.
结论:
- 开发的CRISPRi系统为研究直接TF函数提供了一个强大的方法.
- 该协议通过隔离初级TF效应来促进基因调节网络的剖析.
- 该系统对干细胞生物学和发育过程的研究有价值.
