基因基因特异性的CRISPR-Cas9编辑使与原VI肌肉发育不良相关的单核酸变体失活

科学领域:

• 遗传学 遗传学 是一个
• 分子生物学分子生物学
• 生物技术是生物技术.

背景情况:

• 主导遗传条件带来了治疗挑战,通常需要基因纠正或非激活.
• 对等位基因特定的基因编辑为治疗这些疾病提供了潜在的策略.
• 与 COL6A1 变体相关的先天性肌肉发育不良症呈现出严重的主导阴性状况.

研究的目的:

• 开发和评估基因向的CRISPR-Cas9指导RNA (gRNAs),用于 COL6A1 基因中的主导阴性SNV 失活.
• 评估患者衍生纤维细胞中这些gRNA的等位基因选择性.
• 为治疗应用设计具有增强选择性的gRNA.

主要方法:

• 利用基因基因向的CRISPR-Cas9 (SpCas9) 和gRNAs在COL6A1 c.868G>A (G290R) 变异中引入框架转移的内接.
• 从患者和没有修复模板的对照对象的初级纤维细胞中表达了SpCas9和gRNA.
• 采用AMPLICON深度测序来分析基形成和等位基活性.
• 引入了gRNA中的不匹配,以增强等位基因选择性.

主要成果:

• 在CRISPR-Cas9向中,G290R等位基因中引入了框架转移的缺失,主要是单核酸缺失.
• 最初的gRNAs在与疾病相关的G290R等位基因和野生类型等位基因上都表现出活性.
• 优化的gRNAs添加了不匹配,在野生类型的等位基因上表现出减少的活性.
• 一个优化的gRNA成功生成了生产性编辑,并改善了患者纤维细胞中的原VI矩阵.

结论:

• 对等位基因特异性基因编辑具有治疗诸如先天性肌肉发育不良等主导负性疾病的潜力.
• 通过CRISPR-Cas9 gRNAs实现高等位基因选择性仍然是一个挑战.
• 具有故意不匹配的工程gRNA可以提高准特异性和治疗疗效.