基于寡核酸的CRISPR-Cas9工具箱,用于高效地设计Komagataella phaffii
Tomas Strucko1, Adrian-E Gadar-Lopez1, Frederik B Frøhling1
1Section for Synthetic Biology, Department of Biotechnology and Biomedicine, Technical University of Denmark, Søltofts Plads 223, 2800 Kongens Lyngby, Denmark.
我们开发了一种多功能CRISPR-Cas9系统用于Komagataella phaffii (Pichia pastoris) 酵母,使得使用短DNA片段进行高效的基因编辑. 这加速了K. phaffii的生物生产工程.
科学领域:
- 微生物学 微生物学
- 分子生物学分子生物学
- 生物技术是生物技术.
背景情况:
- 科马加塔 (Pichia pastoris) 是异质蛋白表达的关键宿主.
- 有限的遗传工具阻碍了K. phaffii.的充分生物生产潜力.
- 克里斯普尔-Cas9已经改善了基因操纵,但需要进一步的改进.
研究的目的:
- 为K. phaffii.开发一个高效和多功能的CRISPR-Cas9基因编辑系统.
- 为了使精确的基因修改使用短的DNA片段和寡核酸.
- 为了促进K. phaffii的工程,以提高生物生产.
主要方法:
- 开发了一种基于载体的CRISPR-Cas9方法,用于K. phaffii.
- 利用线性DNA片段,包括单链寡核酸 (ssODNs),用于基因编辑.
- 实施了一种短暂的KU70基因破坏策略,以有利于精确的编辑并允许逆转.
主要成果:
- 在各种遗传位置展示了有效的CRISPR-Cas9活动.
- 通过使用短 (90 nt) ssODNs.实现高效的特定位点突变和基因删除.
- 成功使用视觉标记系统暂时禁用非同类末端连接 (NHEJ) 途径.
结论:
- 展示的CRISPR-Cas9工具使得K. phaffii. 的高效和精确的工程成为可能.
- 该系统支持多重编辑,兼容高吞吐量工作流.
- 这些进展加速了K. phaffii菌株用于工业生物生产的开发.
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11:35Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells
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07:46CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.
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