使用过氧化酶APEX2生物标记方法识别哺乳动物细胞中RNA结合蛋白的内源相互作用者的协议
Ryota Uozumi1, Kohji Mori1, Shoshin Akamine1
1Department of Psychiatry, Graduate School of Medicine, Osaka University, Suita, Osaka 565-0871, Japan.
STAR protocols
|October 11, 2024
概括
本研究详细介绍了一种方法,用于识别活细胞中的RNA结合蛋白 (RBP) 相互作用,使用工程化阿斯科巴特过氧化酶2 (APEX2). 该协议使近距离标记和质谱分析能够用于RBP互动原子映射.
科学领域:
- 分子生物学分子生物学
- 生物化学 生物化学
- 细胞生物学 细胞生物学
背景情况:
- 工程酸盐过氧化酶2 (APEX2) 是研究细胞内分子-分子相互作用的强大工具.
- 识别RNA结合蛋白 (RBPs) 的相互作用体对于理解基因调节至关重要.
- 现有的方法可能在研究活细胞内的RBPs方面存在局限性.
研究的目的:
- 介绍一个详细的协议,用于识别活的HeLa细胞中的RNA结合蛋白相互作用体.
- 适应APEX2近距离标记系统用于RBP互动原子分析.
- 提供一种可重复的方法,用于基于质谱的RBP结合伙伴的识别.
主要方法:
- 产生与APEX2 (RBP-APEX2) 结构融合的RNA结合蛋白.
- 在活的HeLa细胞中依靠近距离的生物化标记.
- 生物化蛋白质的制备用于质谱 (MS) 分析.
主要成果:
- 成功生成和应用RBP-APEX2融合蛋白.
- 对RBP相互作用器有效的近距离生物标签的演示.
- 通过质谱测量识别潜在的RBP绑定合作伙伴.
结论:
- 本协议允许在活细胞中识别RNA结合蛋白相互作用体.
- 这种基于APEX2的方法为绘制RBP互动组提供了一种有价值的方法.
- 该协议有可能适应各种细胞类型和其他感兴趣的RBPs.


