内源性Cu (II) 用EPR对蛋白质进行距离测量的标记
Hannah R Hunter1, Shashank Kankati1, Zikri Hasanbasri1
1Department of Chemistry, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, 15260, USA.
Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany)
|October 14, 2024
概括
这项研究引入了一种新的方法,用于在细胞中使用铜 (II) 标记蛋白质的内源旋转. 假定性膨胀有效地提供旋转标签,使生物物理学可访问的细胞内结构和动态研究.
科学领域:
- 生物物理学的生物物理.
- 结构生物学 结构生物学
- 生物化学 生化学
背景情况:
- 细胞内生物物理研究需要了解蛋白质结构-动力学-功能关系.
- 电子磁共振 (EPR) 光谱对于细胞内结构测量具有强大作用.
- 目前用于细胞内EPR标签的方法受到外源标签或非正规氨基酸的需求的限制.
研究的目的:
- 开发和验证一种使用Cu (II) 旋转标签在活细胞内的蛋白质内源自旋转标签的方法.
- 建立评估细胞内旋转标签效率和量化标签度的协议.
- 为了比较不同的输送方法,将旋转标签输入细菌细胞.
主要方法:
- 使用铜 (II) - 亚酸 (Cu (II) - NTA) 的蛋白质的内源性旋转标签.
- 细胞内Cu (II) -NTA度的量化.
- 评估旋转标签的效率,并考虑定向效应.
- 热冲击与细胞输送的低压胀的比较.
主要成果:
- 低位性胀被证明是一种简单且可重复的方法,可以有效地将Cu (II) -NTA输入大肠杆菌.
- 在六次重复中获得了57μM的散装平均,超过了以前的内源标记方法.
- 建立了量化标签吸收和评估标签质量的方法.
结论:
- 这项工作为生物物理学界提供了一种可访问的内源性旋转标签方法.
- 开发的方法促进了蛋白质功能的细胞内结构和动态研究.
- 高效的旋转标签的细胞传递对于稳健的细胞内EPR测量至关重要.
