循环捐赠者的特定站点整合改善了人体细胞系中CRISPR/Cas9介导的同源重组
Zhimei Liu1, Yue Zhao1, Sujun Wu1
1Beijing Key Laboratory for Animal Genetic Improvement, National Engineering Laboratory for Animal Breeding, Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding of the Ministry of Agriculture, College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China.
这项研究介绍了一种优化的CRISPR/Cas9方法,使用圆形DNA模板,以高效地,特定地点整合长基因片段. 这种方法提高了基因敲进效率,简化了蛋白质表达细胞系的创建.
科学领域:
- 分子生物学分子生物学
- 基因编辑技术的技术
- 生物技术是生物技术.
背景情况:
- 克里斯普尔/卡斯9系统能够实现特定位点的基因整合,但长DNA片段仍然存在挑战.
- 传统的载体通常包括 prokaryotic backbones,可能会阻碍效率.
- 从集成的长片段中有效地表达活性蛋白质,需要优化交付和集成策略.
研究的目的:
- 开发一个优化的CRISPR/Cas9策略,以高效地,特定地点整合长DNA片段.
- 创建一个同类的无手臂循环供体模板,以提高敲进效率.
- 从整合的长片段中证明这种方法在产生表达记者基因的细胞系时的实用性.
主要方法:
- 优化一个线性DNA循环化系统,以创建一个圆形的捐赠者模板.
- 从外来基因载体中清除 prokaryotic 质粒骨干.
- 生成一个同源的无臂循环供体模板,单一指导RNA点 (sgRNA TS).
- 将圆形供体模板和Cas9等离子体共同转化为HEK293T细胞.
- 在特定的基因组位点中集成一个含有记者基因 (rhBCHE) 的5.4kb片段.
主要成果:
- 一个1.6kb模板和Cas9等离子体的同传染效率增加了1.15倍.
- 在两个目标站点上,4.7kb长片段模板的平均敲入效率 (KI) 增加了1.3倍.
- 一个含有 rhBCHE 记者基因的 5.4 kb 片段的成功整合和表达.
- 证明了更长的循环捐赠者可以促进非同类整合.
结论:
- 开发的策略显著提高了使用CRISPR/Cas9.9的长DNA片段的特定地点集成的效率.
- 循环捐赠者模板,特别是较长的,在非同类整合中更有效.
- 这种优化的方法提供了一种简单而高效的方法,用于构建细胞系,用于兴趣基因 (GOI) 表达的整合长片段.
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