在没有N端修饰的情况下,对人类细胞染色体P450 3A4的细菌表达,净化和表征
Yudong Sun1, Yoichi Osawa1, Haoming Zhang1
1Department of Pharmacology, The University of Michigan Medical School, Ann Arbor, MI, 48109, USA.
Archives of biochemistry and biophysics
|November 10, 2024
概括
我们开发了一种细菌系统,以过度表达野生型 (WT) 人类CYP3A4,达到高表达水平. 这种WT酶与改性形式相比,表现出明显的激素结合和活性,这表明N端影响相互作用.
科学领域:
- 生物化学 生物化学
- 分子生物学分子生物学
- 酶学 是一种酶学.
背景情况:
- 人类CYP3A4对药物代谢至关重要.
- 在细菌中有效表达功能性CYP3A4具有挑战性.
- 了解CYP3A4的结构功能关系对于药物开发至关重要.
研究的目的:
- 建立一个高水平表达全长野生类型 (WT) 人类CYP3A4.4的细菌系统.
- 为了净化和描述表达的WT CYP3A4.4.
- 为了比较WT CYP3A4的功能性质与N端修饰形式 (CYP3A4-NF14) 的功能性质.
主要方法:
- 将CYP3A4 WTcDNA克隆成一个pLW01-P450载体.
- 与GroEL/ES伴侣体在C41(DE3) 大肠杆菌细胞中的同表达.
- 使用Ni-Penta agarose染色学和功能测试进行净化.
主要成果:
- 获得了WT CYP3A4 (495 nmol/L培养) 的高表达.
- 纯化的WT CYP3A4具有高特异性含量 (14.3 ± 2.0 nmole P450/mg蛋白).
- 与CYP3A4-NF14相比,WT CYP3A4表现出西格状结,降低6β-基酶活性,并减少了POR依赖性.
结论:
- 细菌系统能够有效地产生WT人类CYP3A4.4.
- WT CYP3A4的N端膜可以增强POR相互作用和结合.
- 这些发现为CYP3A4的酶机制和相互作用提供了洞察力.
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