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Updated: Jun 7, 2025
08:20
Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9
Published on: November 3, 2020
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有效的CRISPR/Cas9敲入方法用于操纵人类B淋巴瘤细胞内源基因
Laura A Murray-Nerger1,2,3,4, Benjamin E Gewurz1,2,3,4
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts.
Current protocols
|November 13, 2024
概括
这项研究提供了有效的CRISPR/Cas9敲入B淋巴细胞的协议,使研究能够精确地标记内源蛋白质. 这些方法克服了B细胞中的挑战,促进了蛋白相互作用和局部化的下游分析.
科学领域:
- 分子生物学分子生物学
- 细胞生物学 细胞生物学
- 基因编辑 基因编辑
背景情况:
- 传统的过度表达技术限制了对内源蛋白质动态的理解.
- 基于CRISPR的敲门方法提供了高效的内源蛋白标记,但在特定细胞类型 (如B淋巴细胞) 中面临挑战.
- 特别是B淋巴细胞对标准的传染方法具有耐火性,阻碍了敲进效率.
研究的目的:
- 在B淋巴瘤细胞中提供有效的CRISPR/Cas9中介敲门的详细方案.
- 为了解决和改善B淋巴细胞的内置效率变异性.
- 为了能够精确研究内源蛋白相互作用,局部化和表达.
主要方法:
- 优化单向导RNA (sgRNA) 对目标基因位置的选择.
- 在基因组敲门站点评估Cas9编辑效率.
- 设计和克隆用于光标记器集成的维修模板.
- 利用电穿孔和单细胞克隆进行工程B细胞选择.
主要成果:
- 详细的CRISPR/Cas9敲进B淋巴瘤细胞的协议提供.
- 建立了评估sgRNA效率和Cas9编辑的方法.
- 标记内源性蛋白质或共同表达标记物的方法有助于选择内置细胞,即使效率低.
结论:
- 开发的工作流程使得有效的CRISPR/Cas9在B淋巴细胞中敲进.
- 这种方法可以为下游分析提供内源蛋白标签的精确工程.
- 预计这些协议将广泛适用于用于内源基因编辑的其他细胞类型.
