开发一种His-Tag介导的拉下和定量测试,用于含有DNA序列的G-quadruplex
Enrico Cadoni1, Hanne Moerman1, Annemieke Madder1
1Organic and Biomimetic Chemistry Research Group, Department of Organic and Macromolecular Chemistry, Ghent University Krijgslaan 281-S4 9000 Gent Belgium Annemieke.madder@ugent.be Enrico.cadoni@ugent.be.
RSC chemical biology
|December 5, 2024
概括
我们开发了一种使用核酸 (PNA) 与His-Tag和G-quadruplex (G4) 连接体进行DNA序列检测的简单的下拉试验. 这种方法增强了G4形成DNA的恢复和选择性,提供了一个新的量化策略.
科学领域:
- 生物化学 生物化学
- 分子生物学分子生物学
- 分析化学 分析化学
背景情况:
- 越来越多地认识到G-四重复 (G4) DNA结构在各种生物过程中的作用.
- 准确检测和量化G4DNA对于理解它们的功能至关重要.
- 现有的G4DNA分析方法往往在特异性和效率方面面临挑战.
研究的目的:
- 开发一种新的,简单的,高度选择性的拉下测试,用于G-四重复 (G4) DNA序列.
- 为了使G4形成DNA的有效恢复和准确量化.
- 为了验证测试的性能和适应性,用于高吞吐量应用.
主要方法:
- 一个拉下测试被设计使用核酸 (PNAs) 功能化与His-Tag和G-quadruplex (G4) 连接体.
- 磁性Ni-NTA珠子被用于有效捕获His标记的PNAs和结合的G4DNA.
- 通过利用G4/hemin复合体的类似酶的活性来实现量化.
- 高性能液体染色学 (HPLC) 用于测试验证.
- 测量被调整为一个96井板格式.
主要成果:
- 优化的缓冲条件和磁性Ni-NTA珠子促进了G4DNA目标的高效和特定的恢复.
- 在His-Tag和Ni-NTA磁珠系统显示出优越的恢复与生物素-斯特雷普塔维丁净化相比.
- 将G4连接体作为额外的选择性处理器显著改善了目标恢复和试验特异性.
- G4/hemin复合物的催化活性为G4 DNA量化提供了可靠的方法.
- 该试验成功验证并适应96井板格式,表明其对高通量查的潜力.
结论:
- 开发的基于PNA的拉下测试为G4DNA识别和量化提供了一个简单,高效和选择性的方法.
- 希斯-Tag/Ni-NTA珠子和G4连接体的组合增强了回收和特异性,优于传统的净化方法.
- 该测试对96孔格式的适应性使其成为各种研究和诊断应用中G4DNA分析的宝贵工具.
