针对谷氨酸脱碳酶B的定向演化,以增强其酶活性,以接近中性pH值,基于易出错的PCR
Fuyao Guan1, Bing Fu2, Peize Wang1
1College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, 149 Jiaogong Road, Hangzhou, Zhejiang Province 310035, People's Republic of China.
International journal of biological macromolecules
|December 30, 2024
概括
研究人员设计了谷氨酸脱碳酶 (GAD) 酶,以在中性pH下增强活性. 定向进化创造了一个突变的GadB酶,GadBD304G/F433L,在中性条件下显著提高了性能.
科学领域:
- 生物化学 生物化学
- 酵素工程是什么意思 酵素工程
- 分子生物学分子生物学
背景情况:
- 谷氨酸脱碳酶 (GADs) 将l-谷氨酸转化为γ-氨基黄油酸 (GABA).
- 现有的GAD在酸性pH (3.8-5.0) 时表现出最佳活性,在中性pH (>5.0) 时被禁用.
- 对于更广泛的应用,需要在几乎中性的pH值下功能性的GAD.
研究的目的:
- 在几乎中性pH下设计具有高活性的谷氨酸脱碳酶 (GadB).
- 为了确定赋予改善pH稳定性和催化效率的突变.
- 阐明工程酶中pH适应的机制.
主要方法:
- 使用易发生错误的PCR对gadB基因的定向进化.
- 在大肠杆菌BL21(DE3) 中构建一个随机突变性库.
- 高通量选使用莫提摩尔蓝用于pH活性突变物.
- 用于酶分析和分子对接模拟的突变GadB的净化.
主要成果:
- 一个双重突变,GadBD304G/F433L,被确定具有显著增强的活动.
- 与野生型GadB.相比,pH值在5.8时活动增加了935.90%,pH值在6.6时增加了984.31%,与野生型GadB.相比.
- 分子对接揭示了突变者增加的键和较低的结合能,表明基质亲和力更高.
结论:
- 设计的GadBD304G/F433L在几乎中性pH下表现出强大的活性.
- 突变D304G和F433L对于提高催化效率和pH适应至关重要.
- 这项工作为在中性pH环境中利用GadB提供了基础.
