一个可信度辅助的策略,兼容解决小型MFS运输器结构在多个构造使用冷-EM使用的多重构造

科学领域:

• 结构生物学 结构生物学
• 生物物理学的生物物理.
• 分子生物学分子生物学

背景情况:

• 低温电子显微镜 (cryo-EM) 已经推进了结构生物学,但对于小膜蛋白 (<40 kDa) 仍然存在挑战.
• 从单个样本中确定多个蛋白质构造是很困难的,特别是对于载体和G蛋白结合受体.
• 缺乏可区分的特征阻碍了这些蛋白质的图像对齐和结构确定.

研究的目的:

• 开发一种策略,以确定接近尺寸值的膜传送器的高分辨率冷电磁结构.
• 为了能够在单个样本中表征多个构造状态.
• 验证一种新的融合构造方法,用于对主要促进者超级家族 (MFS) 载体进行冷电磁研究.

主要方法:

• 使用聚氨酸链接器将目标传送器的C端与BRIL域融合.
• 使用AlphaFold2预测来指导构造设计,并最大限度地减少硬体碰撞.
• 采用BRIL特定的Fab片段来增强粒子定向和图像对齐.
• 应用冷EM来阐明Staphylococcus aureus NorA载体和其他三种MFS载体的结构.

主要成果:

• 成功确定了42kDa NorA传送器的四个冷电磁结构.
• 从单个样本中解决了NORA的三个不同的构造 (向内开放,向内封闭,封闭).
• 验证了三个额外的MFS运输器 (GlpT,Bmr,Blt) 的融合战略,证实了刚性链接器的实用性.
• 证明AlphaFold2预测有助于高效的构造设计.

结论:

• 布里尔的融合策略是有效的冷-EM结构的确定小膜载体,包括MFS家族成员.
• 这种方法有助于从单个实验中捕获和分析各种蛋白质构造.
• 这种方法显著减少了猜测和选,使得冷EM更容易用于研究膜蛋白动力学.