优化针对转基因磁带的有针对性的集成方法,通过在小鼠和人类干细胞中通过集成酶介导的磁带交换来实现

科学领域:

• 干细胞工程 干细胞工程
• 基因编辑技术 基因编辑技术
• 分子生物学分子生物学

背景情况:

• 重组酶介导的磁带交换 (RMCE) 对于干细胞中转基因表达至关重要.
• 选择合适的复合酶酶对于高效准确的DNA整合至关重要.
• 安全港位点,如Gt(ROSA) 26Sor和AAVS1,是稳定的转基因表达的目标.

研究的目的:

• 为了比较血清重组酶 (PhiC31,W-β,Bxb1) 在老鼠胚胎干细胞中转基因整合的效率.
• 评估Bxb1系统在AAVS1位点的人类诱导多能干细胞 (hiPSCs) 中的磁带交换.
• 评估CAG和Ef1α促进剂在hiPSC中驱动转基因表达的适用性,并验证基于CRISPR的基因调节工具的整合.

主要方法:

• 直接比较PhiC31,W-β和Bxb1整合酶在Gt(ROSA) 26Sor位点的转基因整合效率.小鼠胚胎干细胞.
• 适应Bxb1系统在hiPSC中的AAVS1位点进行磁带交换,测试CAG和Ef1α促进体.
• 在hiPSC中使用Bxb1系统集成CRISPR激活和CRISPR抑制机制.

主要成果:

• 这三种整合酶 (PhiC31,W-β,Bxb1) 都支持高效的工程和与多能性和生殖系传播相容的长期表达.
• 与PhiC31和W-β相比,Bxb1整合酶的效率是PhiC31和W-β的2-3倍.
• 在AAVS1-集成的hiPSC中,CAG促进剂驱动了一致和稳定的表达,而Ef1α促进剂导致了马赛克表达.
• 在hiPSC中使用集成的CAG驱动的CRISPR激活和CRISPR抑制机制实现了强大的sgRNA诱导的基因上下调节.

结论:

• Bxb1整合酶是一种高效的工具,用于在老鼠和人类干细胞中进行特定部位的整合.
• 该CAG促进体优于Ef1α在驱动稳定的转基因表达在hiPSCs的AAVS1位点.
• Bxb1整合酶系统有效地将基于CRISPR的功能基因调节工具集成到hiPSC中,从而能够精确控制基因表达.