通过合理设计的反转终端重复,通过hESCs限制AAV载体转导和减弱毒性

科学领域:

• 分子生物学分子生物学
• 干细胞生物学 干细胞生物学
• 病毒学 病毒学

背景情况:

• 腺相关病毒 (AAV) 的反转终端重复 (ITR) 可以在人类胚胎干细胞 (hESCs) 中触发p53依赖的亡.
• 了解ITRs在hESC毒性中的作用对于开发用于基因治疗的安全AAV载体至关重要.

研究的目的:

• 研究修改合成ITRs (SynITRs) 对AAV载体的产生,基因传递和hESC中毒性的影响.
• 阐明hESCs中ITR介导毒性和DNA损伤反应背后的机制.

主要方法:

• 具有改变p53结合位点的SynITRs的生成和表征.
• 含有野生型 (wt) ITR 和 SynITR 的 AAV2 载体的生产和定位.
• 评估载体转导效率,hESC毒性,粒子进入,插曲形成和记者基因表达.
• 在载体感染后对DNA损伤标记物 (γH2AX) 和p53异型激活 (p53α,p53β,p53ψ) 的分析.

主要成果:

• 含有SynITR的AAV载体与wtITR载体类似地复制,在人类细胞中产生可比的载体标位和转导效率,而无毒性.
• 在hESC中,AAV2-SynITR载体显著减弱了由AAV2-wtITR载体诱导的亡.
• 虽然粒子进入和插曲丰度相似,但从SynITR基因组中减少了记者表达.
• ITR修饰未合正规的p53α激活,但γH2AX诱导和p53β/p53ψ激活独立于ITR序列发生.

结论:

• 设计的SynITR通过调节p53激活通路来减轻hESC中AAV介导的毒性.
• AAV载体感染会在hESC中触发不同的DNA损伤反应,包括构成性p53β活动和ITR独立的p53ψ激活.
• ITR工程代表了一种可行的策略,可以限制AAV矢量传导和操纵hESC中的DNA损伤反应,从而提高矢量安全性.