检查用光基因替换ORF3a的可行性,以构建SARS-CoV-2记者病毒

科学领域:

• 病毒学 病毒学
• 分子生物学分子生物学
• 免疫学 免疫学 免疫学

背景情况:

• 在SARS-CoV-2基因组编码辅助蛋白质,包括ORF3a,它调节天生的免疫反应.
• 了解ORF3a的功能对于开发抗病毒策略至关重要.

研究的目的:

• 调查ORF3a在SARS-CoV-2复制和免疫逃避中的作用.
• 为了生成和描述重组的SARS-CoV-2病毒,ORF3a被光记者基因 (mScarlet和mNeonGreen) 取代.

主要方法:

• 通过替换ORF3a基因,构建复合SARS-CoV-2病毒 (rSARS-CoV-2-Δ3a-mS和rSARS-CoV-2-Δ3a-mNG) 的方法.
• 细胞系感染 (A549-ACE-2-TMPRSS2和Vero-E6-TMPRSS2) 以评估病毒复制和蛋白质表达.
• 纳米孔直接RNA测序 (dRNAseq) 用于分析病毒转录组.
• 评估病毒遗传稳定性和斑块形成.
• 对干扰素-α (IFN-α) 和 ruxolitinib 的病毒敏感性的评估.

主要成果:

• rSARS-CoV-2-Δ3a-mNG显示光,而rSARS-CoV-2-Δ3a-mS表达了一个非光蛋白,转录水平低于AAT细胞中检测的水平.
• 在传递过程中,rSARS-CoV-2-Δ3a-mS在mS基因中获得了删除,形成rSARS-CoV-2-Δ3a-ΔmS.
• 与父病毒相比,所有重组病毒表现出较低的复制量和较小的斑块大小.
• 与rSARS-CoV-2-Δ3a-ΔmS相比,rSARS-CoV-2-Δ3a-ΔmS的病毒标位和斑块大小增加,与rSARS-CoV-2-Δ3a-mS相比.
• 再组合病毒对IFN-α的敏感性增加,但对 ruxolitinib 的敏感性没有增加.

结论:

• 用光记者基因替换ORF3a减弱了SARS-CoV-2在体外的复制.
• 在SARS-CoV-2逃避天生的免疫反应的能力中,ORF3a起着重要作用.
• mScarlet插入和ORF3a删除有助于病毒衰减.