通过CRISPR/Cas构建pyrG标记器,可以在工业Aspergillus niger菌株上进行高效的精确基因组编辑

科学领域:

• 微生物学 微生物学
• 分子生物学分子生物学
• 生物技术是生物技术.

背景情况:

• 在工业Aspergillus niger菌株中基于素的基因编辑带来了独特的挑战.
• 在菌株开发中提高工作效率对于工业应用至关重要.

研究的目的:

• 开发一个高效和精确的基因编辑策略,用于工业Aspergillus niger.
• 为了克服传统的基于高胺的选择方法的局限性.
• 建立一个多功能基因工具箱,用于针对性修改A. niger.

主要方法:

• 利用CRISPR-Cas9核糖蛋白 (RNP) 策略,使用双 sgRNA 和修复模板来移除pyrG标记物.
• 开发了一种基于等离子体的策略,以无地淘汰具有挑战性的基因 (Δku70, Δku80).
• 结合微型化种植,使用高胺标记物来选择生长不佳的菌株.
• 为精确点突变 (ERG3^Tyr185) 设计的sgRNA和amds反选择修复模板.
• 建立了一个诊断PCR方法来验证成功的基因编辑.

主要成果:

• 实现了100%的pyrG附属体构造的阳性率,超过了传统方法.
• 证明了基因淘汰的高阳性率:90%的Dku70和50%的Dku80.
• 成功获得了ERG3^Tyr185点突变,几乎100%的阳性率.
• 补充菌株表现出与父菌株相似的发酵特性.

结论:

• 开发的CRISPR-Cas9工具箱为A. niger菌株工程提供了一个高效和精确的策略.
• 这种工具箱克服了以前的局限性,使得无基因淘汰和向点突变成为可能.
• 已确定的方法显著提高了开发工业A. niger菌株的效率.