在Aspergillus nidulans中使用dCas引导的近距离标签的局部特异性色素蛋白质组学

科学领域:

• 分子生物学分子生物学
• 蛋白质组学是指蛋白质组学.
• 遗传学 遗传学 是一个

背景情况:

• 使用混杂生物素连接酶 (BirA) 融合到诱蛋白质的近距离标签可以在体内确定蛋白质相互作用.
• 由sgRNAs指导,与BirA融合的酶性失效的Cas9 (dCas9) 可以针对特定的染色质位置进行蛋白质识别.

研究的目的:

• 适应和验证CasID方法用于在真菌细胞中特定位置的蛋白质识别.
• 为了利用一种可诱导雌激素的dCas9-BirA融合,在Aspergillus nidulans中进行特定条件的标签.
• 在酸盐同化基因群中识别染色质相关蛋白和转录因子相互作用体.

主要方法:

• 在Aspergillus nidulans中适应CasID方法,使用可诱导雌激素的dCas9-BirA融合.
• 染色体免疫沉 (ChIP) 验证dCas9-BirA和转录因子在目标位点的存在.
• 优化CasID,以使用对照菌株 (缺乏sgRNA或CasID系统) 进行高效的标签和背景减少.
• 使用斯特雷普塔维丁树脂对生物化蛋白质的亲和性净化,然后进行LC-MS/MS分析.

主要成果:

• 通过ChIP成功验证了dCas9-BirA和AreA转录因子在目标位点的存在.
• 概念验证证明了与对照对象相比,CasID菌株中的生物化蛋白质的丰富.
• 在背景减少后,在CasID-sgRNA菌株中识别了32种专为CasID-sgRNA菌株丰富的蛋白质,包括NmrA和染色质相关蛋白质.
• 生物化蛋白质的高背景需要严格的控制来进行准确的分析.

结论:

• 该 CasID 方法适用于特定于位点的标签和识别 Aspergillus nidulans 中的染色质相关蛋白和转录因子.
• 该研究提供了在真菌中应用CasID的详细方案.
• 需要进一步优化,以解决生物化和净化步骤中的高背景水平.