使用质谱读数对蛋白质 - 连接物亲和常数进行高通量测试的多重测试

科学领域:

• 蛋白质组学
• 生物化学
• 分子生物学

背景情况:

• 精确的蛋白质相互作用模型需要量化整个蛋白质组的蛋白质 - 连接体亲和关系.
• 对于大规模的亲属性分析,现有的方法在吞吐量和动态范围方面存在局限性.

研究的目的:

• 开发和验证基于质谱的Holdup Multiplex测试,用于高吞吐量,定量分析蛋白质与配体的亲和关系.
• 用该试验来研究人类14-3-3蛋白对素的亲和力,并研究连接体诱导的结合位调节.

主要方法:

• 使用质谱测量 (MS) 量化亲和力测试的Holdup多重测试的开发.
• 对7种人类的14-3-3异型对1000种类蛋白进行分析.
• 使用X射线结晶学验证和PDZ域的可转移性证明.

主要成果:

• 在一次运行中精确量化成千上万的亲和常数, 具有高吞吐量, 动态范围和灵敏度.
• 在14-3-3异构体中确定了分级的亲和关系,14-3-3γ是最强的结合物,14-3-3ε/σ是最弱的结合物.
• 发现了数百个新的14-3-3结合位点,并确定了Fusicoccin-A对数十个位点的调节,影响了关键的信号通路.

结论:

• 霍尔德普多重组是一个多功能和强大的工具,用于定量蛋白质组范围的亲和力概况.
• 这项研究为14-3-3蛋白相互作用及其调节提供了新的见解.
• 该试验广泛适用于可通过质谱测量量各种蛋白质 - 配体相互作用.