优化Legionella表达菌株用于His标记膜蛋白的亲和力净化,消除了主要的多重污染物
Sukhithasri Vijayrajratnam1, Jonasz B Patkowski2, Joshua Khorsandi3
1Department of Molecular Microbiology, Washington University, St. Louis, Missouri, USA.
我们鉴定并去除了一种富含胺的污染蛋白 (Lpg1596),它干扰了-酸-酸 (Ni-NTA) 净化和电子显微镜分析Legionella pneumophila. 删除lpg1596基因解决了这个问题,使得更清洁的蛋白质分离.
科学领域:
- 微生物学 微生物学
- 蛋白质生物化学 蛋白质生物化学
- 结构生物学 结构生物学
背景情况:
- 使用-酸 (Ni-NTA) 亲和力色谱的聚胺标记蛋白质净化是常见的.
- 由内源性胺丰富蛋白质的污染可能会损害净化质量和下游分析,如单颗粒电子显微镜 (EM).
- 在Legionella pneumophila Dot/Icm IVB型分泌系统的净化过程中发现了一种未知的污染物.
研究的目的:
- 确定在Legionella pneumophila中Ni-NTA树脂污染的来源.
- 描述污染蛋白及其结合机制.
- 制定消除污染物的策略,以改善蛋白质净化和分析.
主要方法:
- 质谱测量以确定污染物蛋白质.
- 生物信息分析和蛋白质建模,以预测胺集群.
- 构建和分析一个缺乏污染物基因 (∆lpg1596) 的莱吉欧内拉肺炎突变菌株.
- Ni-NTA亲和力净化和负染色电子显微镜 (EM).
主要成果:
- 质谱测量确定了污染物为Lpg1596,这是enoyl-CoAhydratase的同类物.
- Lpg1596具有表面暴露的胺团,这解释了它对Ni-NTA树脂的亲和力.
- ∆lpg1596突变菌株在Ni-NTA净化中消除了Lpg1596的污染和相关的颗粒形成.
- ∆lpg1596突变并没有损害巨细胞中的细菌复制,这表明它对病原体研究的有用性.
结论:
- Lpg1596是一种常见的Legionella pneumophila中的Ni-NTA结合污染物,它干扰蛋白质净化和EM分析.
- 删除lpg1596基因为清除这种污染物提供了一个强大的解决方案.
- 开发的∆lpg1596突变菌株适合从军团菌中净化His标记蛋白质,促进像单颗粒EM这样的先进分析.
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