小RNA毒素辅助的GC优先ErCas12a的进化,用于增强基因组准范围
Zehua Chen1, Junyuan Xue2, Ziying Wang3
1AIM center, College of Life Sciences and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100101, China.
概括
研究人员开发了增强的Cas12a (enErCas12a),以克服富含胺的PAM限制. 这种新的基因编辑工具有效地准细菌和哺乳动物细胞中富含关氨酸和氨酸的PAMs,扩大了基因组的可访问性.
科学领域:
- 分子生物学分子生物学
- 基因编辑技术的技术
- 生物技术是生物技术.
背景情况:
- 克里斯普尔/Cas12a系统是强大的基因编辑工具,但由于它们对胺丰富的原体空间器相邻基因 (PAM) 的要求而受到限制.
- 现有的Cas12a变种难以获得富含GC的基因组位置,阻碍了更广泛的应用.
- 对于具有扩展PAM特异性的Cas12a变体的需求对于多功能基因编辑至关重要.
研究的目的:
- 为了进化ErCas12a酶以准富含关氨酸-氨酸 (GC) 的PAMs.
- 开发一种用于酶进化的小RNA毒素辅助新战略.
- 创建一个增强的Cas12a (enErCas12a) 变种,具有扩展的PAM配置文件.
主要方法:
- 采用小型RNA毒素辅助进化策略来修改ErCas12a.
- 测试了EnErCas12a识别和向富含GC的PAM (例如,GCCC,CGCC,GGCC) 的能力.
- 在细菌和哺乳动物细胞系统中评估基因编辑效率和特异性.
主要成果:
- 创建了增强的ErCas12a (enErCas12a),能够识别富含GC的PAMs.
- 与野生类型的ErCas12a相比,enErCas12a的目标是PAM序列的五倍.
- 在以前的Cas12a变体无法访问的GC丰富的PAM中实现了高效的基因编辑 (例如,在哺乳动物细胞中>75%的GC含量).
- 对于正规和非正规的PAM目标都表现出高度的特异性.
结论:
- enErCas12a通过实现富含GC的PAM识别,显著扩大了Cas12a系统的准范围.
- 这种工程酶为原核生物和真核生物的基因编辑提供了一个有价值的新工具.
- 开发的进化策略为创建具有量身定制PAM特异性的Cas酶提供了一个框架.
