一种精简的 His-MBP-SpyCas9 协同亲和度净化,没有缓冲区交换,适用于体外裂解应用
Filippo Fronza1, Roberto Verardo2,3, Claudio Schneider1,2
1DME Dipartimento di Medicina, University of Udine, Piazzale Kolbe 1, 33100 Udine, Italy.
MethodsX
|June 9, 2025
概括
我们开发了一个快速的,一天的协议,用双亲关系染色学净化His-MBP-SpyCas9蛋白质. 这种方法简化了净化,并产生了准备用于体外测试的高质量Cas9蛋白.
科学领域:
- 生物化学 生物化学
- 分子生物学分子生物学
- 蛋白质净化 蛋白质净化
背景情况:
- SpyCas9是基因编辑应用中的关键酶.
- 有效净化复合型SpyCas9对于其在生物化学测试中的可靠使用至关重要.
- 现有的净化方法可能耗时,需要多个步骤,增加蛋白质降解或沉的风险.
研究的目的:
- 开发一种简化和高效的协议,用于净化重组His-MBP-SpyCas9蛋白质.
- 为了减少蛋白质净化的时间和复杂性,同时保持蛋白质的完整性和活性.
- 为体外应用提供准备使用的Cas9蛋白制剂.
主要方法:
- 采用了双相亲性染色学方法,结合了固定金属离子相亲性染色学 (IMAC) 和麦芽糖结合蛋白 (MBP) 相亲性染色学.
- 优化了缓冲组合,以消除对染色学步骤之间的缓冲交换步骤的需求.
- 集成的细菌收获,净化和最终产品的准备在一个工作日的过程中.
主要成果:
- 在一天之内成功净化了复合的His-MBP-SpyCas9蛋白.
- 优化的协议最大限度地减少了缓冲区交换,降低了蛋白质沉的风险.
- 纯化的Cas9蛋白质在使用sgRNA和dsDNA-reporter寡核酸的体外裂解试验中得到了验证.
- 来自MBP亲和染色体的化缓冲物被发现适合直接储存,并且蛋白质可以在-20°C下与甘油一起储存,以便立即在体外使用.
结论:
- 开发的协议提供了一种快速有效的方法来净化His-MBP-SpyCas9.
- 这种简化方法简化了蛋白质净化,使高质量的Cas9蛋白更容易获得研究.
- 纯化的蛋白质直接适用于体外裂解试验,节省了研究人员的时间和精力.
关键词:
阿克塔开始开始克里斯普尔是什么意思?克里斯普尔是什么意思?这就是Cas9的情况.Cas9 双联亲和性净化方法这就是FPLC.他的标签是他的标签.他的TRAP 陷这是一个MBP标签.MBPTrap 的意思是 MBPTrap.蛋白质净化 蛋白质的净化这就是SpCas9的意义.这就是SpyCas9的原因.更多相关视频
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