带有截断的Cas12a结合序列的单链HDR模板可以提高初级人类T细胞的内置效率
Ana-Maria Nitulescu1,2, Weijie Du1,2, Viktor Glaser1,2
1Berlin Center for Advanced Therapies, Charité - Universitätsmedizin Berlin, Corporate Member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 13353 Berlin, Germany.
Molecular therapy. Nucleic acids
|June 16, 2025
概括
使用单链DNA捐赠者 (ssCTS) 进行CRISPR-Cas12a基因编辑,为人类T细胞精确的基因编辑提供了一种高效且毒性较低的方法,可实现治疗性转基因的高敲门率.
科学领域:
- 分子生物学分子生物学
- 基因编辑技术的技术
- 免疫治疗是一种免疫疗法.
背景情况:
- CRISPR-Cas12a提供了Cas9的替代品,在富含AT的区域中表现出色,并简化了指导RNA的生产.
- 目前的同质导向修复 (HDR) 依赖于双链DNA (dsDNA) 捐赠者,在高传染剂量下表现出毒性.
- 具有Cas-target-sequences (CTS) 的单链DNA (ssDNA) 捐赠者在减轻Cas9.9的毒性和提高敲门效率方面表现出有希望.
研究的目的:
- 调查AsCas12a Ultra的Cas-target-sequence (CTS) 设计,重点关注PAM定向和约束性要求.
- 在生理条件下评估AsCas12a在ssDNA上的核酶活性.
- 为了证明具有CTS (ssCTS) 的ssDNA捐赠者的高效,低毒性基因敲进人类T细胞中临床相关的转基因的疗效.
主要方法:
- 探索AsCas12a Ultra的Cas-target-sequence (CTS) 设计,包括PAM定向和绑定.
- 在细胞生理学Mg2+度下测定AsCas12a的ssDNA核酶活性.
- 在初级人类T细胞中,将携带临床相关转基因的ssCTS供体输入TCR-CD3复合基因 (TRAC,CD3ζ,CD3ε),然后使用长读测序进行分析.
主要成果:
- 对AsCas12a Ultra的优化CTS设计进行了研究,在生理条件下排除了ssDNase活性.
- 带有CTS (ssCTS) 的单链DNA捐赠者在高剂量下表现出降低的毒性,使得高效的转基因敲入高达0.8kb.
- 对于0.8kb插入到CD3ε位点的内置率达到了90%,长读测序证实了较高的HDR率和较低的部分整合事件,与未经修改的ssDNA相比.
结论:
- 与ssCTS结合的AsCas12a代表了一种有效的基因敲门平台,用于人类T细胞中有效的基因敲门.
- 这种方法比dsDNA捐赠者显著降低了毒性,促进了更大的治疗转基因的输送.
- 开发的ssCTS方法对推进基因免疫疗法和其他T细胞工程应用有前途.
