使用RNA免疫沉和定量PCR直接检测CRISPR-Cas9核糖蛋白基因兴奋剂

科学领域:

• 生物技术是生物技术.
• 分子生物学分子生物学
• 运动科学 运动科学 运动科学

背景情况:

• 使用CRISPR-Cas9等技术的基因兴奋剂对体育的完整性构成重大威胁.
• 世界反兴奋剂机构在2018年禁止基因组编辑,需要先进的检测方法.
• 目前用于基因兴奋剂的检测技术在灵敏度和检测窗口方面存在局限性.

研究的目的:

• 开发和验证一种用于基因兴奋剂的CRISPR-Cas9核糖蛋白 (RNP) 复合体的新,敏感和特定的检测方法.
• 针对与兴奋剂相关的关键基因,包括肌态素 (MSTN),α-actinin 3 (ACTN3),红素受体 (EPOR) 和红素受体 (EPO).

主要方法:

• 开发一种RNA免疫沉,然后进行定量PCR (RIP-qPCR) 试验.
• 在体外检测针对MSTN,ACTN3,EPOR和EPO的CRISPR-Cas9 RNP复合体.
• 在体内使用CRISPR-Cas9 RNP针对小鼠Mstn基因的概念验证.

主要成果:

• RIP-qPCR方法在血中达到0.1 ng/mL的量化极限.
• 在RNP复合体中检测单导向RNA和Cas9蛋白在体外是成功的.
• 在4°C存储的血中,检测持续长达30天.
• 在体内,CRISPR-Cas9 RNP可在肌内注射后长达24小时和静脉注射后长达12小时内检测到.

结论:

• RIP-qPCR是一种高度敏感和特定的方法来检测CRISPR-Cas9 RNPs,为反兴奋剂工作提供了强大的工具.
• 该方法证明了在体育兴奋剂中检测基因编辑的潜力,未来的工作重点是扩大目标基因检测.
• 这一进步解决了当前检测方法的局限性,加强了对抗基因兴奋剂的斗争.