在商用AAV记者载体和质粒中量化DNA点突变
Rebecca Rose1, David J Nolan1, Jonathan A DaRoza1
1BioInfoExperts, Alachua, FL 32615, USA.
Molecular therapy. Methods & clinical development
|June 30, 2025
概括
对腺相关病毒 (AAV) 产品的测序方法进行比较,发现准确度存在显著差异. 用桑格测序和Illumina测序进行单模板放大显示了类似的突变率,而牛津纳米孔技术的突变率要高得多.
科学领域:
- 分子生物学分子生物学
- 遗传学 是一个遗传学.
- 生物技术是生物技术.
背景情况:
- 腺相关病毒 (AAV) 载体对于基因疗法至关重要.
- 准确量化AAV产品中的突变对于安全性和有效性至关重要.
- 现有的测序方法对于检测低频突变的精度可能有所不同.
研究的目的:
- 为了比较三种测序方法的准确性,以量化AAV产品中的点突变.
- 为了评估单模板放大与桑格测序 (STA-桑格),Illumina测序,和牛津纳米孔技术 (ONT) 测序.
- 评估跨不同平台的突变检测的一致性和可靠性.
主要方法:
- 从AAV9记者载体及其等离子体中测序绿色光蛋白 (GFP) 转基因.
- 使用STA-Sanger,Illumina NGS和ONT NGS平台. 这是一个非常好的解决方案.
- 分析每基基突变率和非参考多数变异频率 (MVF) 的相关性.
主要成果:
- STA-Sanger和Illumina显示出类似的低载体每基突变率 (分别为0.016%和0.013%).
- 在ONT测序中,每个基因的突变率显著更高 (载体:2.2%,等离子体:1.3%).
- 与Illumina (R2 = 0.46) 相比,ONT在MVF的载体批量之间显示出更强的相关性 (R2 = 0.91),而不是Illumina (R2 = 0.46).
结论:
- 在AAV产品中观察到单核酸突变的证据.
- 测序平台之间缺乏一致性凸显了AAV质量控制的潜在挑战.
- AAV行业需要为标准化QC协议开发更准确的测序方法.
