超敏感cDNA图书馆 准备用于从小细胞外囊中测序微RNA的下一代测序
Olivier Loudig1, Iddo Z Ben-Dov2, Beny Shapiro3
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health (HMH); Oncology department, Georgetown University; olivier.loudig@hmh-cdi.org.
Journal of visualized experiments : JoVE
|June 30, 2025
概括
小型细胞外囊泡 (sEVs) 是细胞通信的关键. 一种新方法使得对sEV微RNAs (miRNAs) 的敏感检测能够用于生物标志物发现,即使RNA数量很低.
科学领域:
- 分子生物学分子生物学
- 生物化学 生物化学
- 基因组学就是基因组学.
背景情况:
- 小型细胞外囊泡 (sEVs) 通过像microRNAs (miRNAs) 这样的封装分子调解细胞间的通信.
- 分析sEV-miRNAs有可能识别疾病的新型循环生物标志物.
- 从孤立的sEV中产生较低的miRNA产量挑战了传统的量化方法.
研究的目的:
- 评估一种适应的cDNA库准备程序,用于对sEV衍生的miRNA进行敏感和可重现的分析.
- 通过转录条码方法增强sEVmiRNA分析的测序和复杂化能力.
主要方法:
- 针对低输入RNA优化的cDNA库准备协议的调整,结合对结对,双索引测序的转录条形码.
- 从不同数量的SEV (2.5×10^7到8.4×10^9) 中提取的RNA的分析,包括16个复制品.
- 使用下一代测序 (NGS) 评估方法的可复制性和灵敏性.
主要成果:
- 经过调整的协议在检测sEV-miRNA配置文件方面显示出高的可重现性和灵敏性.
- 只有3.15 pg的总小非编码RNA或1.35 pg的miRNA才能成功量化.
- 使用16 3'腺化DNA条形码改善了测序和多重化能力.
结论:
- 开发的方法允许从有限的SEV数量中对miRNA货物的敏感和可重现的分析.
- 这种方法促进了sEV-miRNAs作为潜在生物标记物的使用,克服了以前的量化限制.
- 优化的协议支持强大的分析,以推进基于细胞外囊的诊断和研究.
