基于生物发光的试验,用于量化活细胞内源蛋白相互作用
Andrew L Niles1, Michael R C Dibble1, Thomas Machleidt1
1Research and Development, Promega Corporation, Madison Wisconsin, USA.
The Journal of biological chemistry
|July 5, 2025
概括
这项研究引入了一种使用NanoBiT和NanoBRET技术的新方法,用于精确测量活细胞内源蛋白与蛋白相互作用 (PPI). 这种方法提高了涉及破坏PPI的疾病药物发现的准确性.
科学领域:
- 细胞生物学 细胞生物学
- 生物化学 生物化学
- 药物发现 药物发现 药物发现
背景情况:
- 蛋白与蛋白相互作用 (PPI) 对细胞功能至关重要,并与各种疾病有关.
- 目前的方法经常使用人工过度表达,不反映本地细胞条件.
- 针对PPI是开发新疗法的关键策略.
研究的目的:
- 评估NanoLuc二进制技术 (NanoBiT) 和NanoLuc生物发光共振能量转移 (NanoBRET) 用于活细胞内源性PPI的量化.
- 建立一个强大的工作流程,用于生成用于研究PPI动态的记者细胞系.
- 提高活细胞试验对药物发现的相关性和预测能力.
主要方法:
- 通过CRISPR介导的基因组工程来用NanoBiT/NanoBRET标签标记内源蛋白质 (EGFR/GRB2,Kras/CRAF).
- 使用DLD-1和HCT 116细胞系进行单层培养和3D球形模型的测试.
- 使用终点,动力测量和发光成像来量化PPI.
主要成果:
- 成功生成了具有内源标记蛋白质的细胞系,用于NanoBiT/NanoBRET试验.
- 在标准细胞培养和更复杂的3D球形模型中证明了PPI的量化.
- 验证了在与癌症相关的同源细胞系中研究PPI的工作流.
结论:
- 开发了一种多功能和模块化的工作流程,用于创建内源调节的PPI报告者细胞系.
- 这种方法为活细胞PPI分析提供了一个更具生物相关性的平台.
- 这种方法为了解信号通路和特征PPI向药物提供了有价值的工具.
