在具有低生物素透性的哺乳动物细胞系中APEX2RNA近距离标记

科学领域:

• 分子生物学分子生物学
• 细胞生物学 细胞生物学
• 生物化学 生物化学

背景情况:

• 亚细胞RNA局部化对于细胞功能至关重要,包括发育和应激反应.
• 接近标记技术,如APEX2,在检测局部转录和丰富蛋白质的传统方法上提供了优势.
• 标准的APEX2近距离标记协议在生物素透性低的细胞系中面临挑战,例如人类诱导的多能干细胞 (hiPSCs).

研究的目的:

• 解决在生物素透性差的细胞系中标准APEX2近距离标签的局限性.
• 在hiPSCs和MCF10A细胞中开发一个优化的协议,以实现高效和均的近距离标记.
• 将APEX2近距离标签的实用性扩展到更广泛的细胞类型.

主要方法:

• 通过在生物素化期间添加温和洗剂来增强生物素吸收,调整了APEX2近距离标签协议.
• 利用了快速的过氧化驱动的APEX2反应.
• 包括对非特定分子定位的控制,并采用数据分析的统计方法.

主要成果:

• 经过调整的协议成功实现了高PSC的高效近距离标签,克服了以前的限制.
• 在MCF10A乳腺上皮细胞中实现了单细胞均生物化.
• 结果发现,低生物素透性是标准协议中标签失败或低效的主要原因.

结论:

• 修改后的APEX2近距离标签协议显著提高了低生物素透性细胞系的标签效率和同质性.
• 这种优化的方法扩大了APEX2近距离标签的应用范围,用于在具有挑战性的细胞模型中研究转录和蛋白质定位.
• 该协议为研究对生物过程至关重要的亚细胞局部化提供了一个强大的方法.