改进了Saccharomyces cerevisiae中反子介导的CRISPR-Cas9基因组编辑的载体

科学领域:

• 分子生物学分子生物学
• 遗传学 是一个遗传学.
• 酵母生物学的酵母生物学

背景情况:

• 在遗传学研究中,局部定向突变发生至关重要.
• 克里斯普尔-Cas9系统提供高效的基因编辑,但在某些酵母菌株有局限性.
• 目前的方法需要复杂的克隆,对于原生酵母来说效率较低.

研究的目的:

• 开发一种基于CRISPR的简化和高效的系统,用于Saccharomyces cerevisiae的体内局部导向突变发生.
• 克服现有方法在完全原性酵母菌株的局限性.
• 集成指导RNA和修复模板,以简化编辑.

主要方法:

• 开发了一种联合表达Cas9-E大肠杆菌逆子 (EcRT) 的单质粒系统和指导RNA修复模板.
• 使用EcRT生成的多副本单链DNA (msDNA) 进行高效的同源重组.
• 结合了各种可选择的标记物 (抗生素和辅助营养) 以提高原型营养酵母菌株的灵活性.
• 创建了可诱导银河糖和可诱导β-雌激素的系统.

主要成果:

• >95%的点突变编辑效率.
• 对于没有标记的删除,编辑效率>50%.
• 在完全原性野生酵母菌株中表现出高效率.
• 减少了突变发生所需的步骤数量和时间.

结论:

• 这种新的基于等离子体的系统显著简化和增强了酵母中CRISPR介导的局部导向突变发生的过程.
• 这种方法有效用于各种编辑,包括点突变和删除,在不同的酵母菌株.
• 为研究人员提供了详细的协议,以实施这种高效的遗传工具.