改造的Un1Cas12f1增强了基因编辑活动,并扩大了基因组覆盖范围

科学领域:

• 分子生物学分子生物学
• 基因编辑技术的技术
• 生物技术是生物技术.

背景情况:

• 紧的可编程核酶对基因组编辑有价值,并且具有治疗前景,特别是当通过腺相关病毒 (AAV) 载体传递时.
• 目前的核酶面临的局限性是由于低于最佳的编辑效率和严格的原体空间相邻动图 (PAM) 要求,阻碍了实际应用.
• 开发更高效和多功能基因组编辑工具对于推进基因治疗至关重要.

研究的目的:

• 设计一个优化的Un1Cas12f1变体,改进编辑活动,减少非目标效果,并扩大PAM特异性.
• 评估工程核酶MiniCasUltra的有效性,用于在小鼠模型中同时进行体内基因编辑.
• 评估MiniCasUltra在治疗新血管与年龄相关的黄斑退化方面的治疗潜力.

主要方法:

• 理性突变发生被用来从Un1Cas12f1.1.中设计MiniCasUltra.
• 将MiniCasUltra的编辑活动和非目标效应与现有工具进行了比较.
• 在小鼠肝脏*Pten*和*Fah*的同时基因编辑是使用编码MiniCasUltra的单个AAV矢量和两个单导向RNA实现的.
• 通过AAV传递MiniCasUltra,以向肌新血管化的小鼠模型中的血管内皮生长因子A.

主要成果:

• 与Un1Cas12f1.1相比,MiniCasUltra显示编辑活动增加了6倍.
• 工程核酶表现出最小的脱效应,打开/关闭目标比率大于10.
• MiniCasUltra 拥有 5'-WBTR 的扩展 PAM 偏好,包括像 5'-TCTG.这样的非正规站点.
• 在小鼠肝脏中同时编辑*Pten*和*Fah*,比CasMINI V3.1.1.产生明显更高的indel率 (15.82%和29.39%),而不是CasMINI V3.1.1.
• 在小鼠模型中,MiniCasUltra的AAV输送成功地减少了胆道新血管化病变.

结论:

• MiniCasUltra代表了基因组编辑技术的重大进步,提供了更高的有效性和多功能性.
• 其紧的尺寸,高活性和广泛的准范围使其适用于体内应用.
• MiniCasUltra显示出开发针对遗传性疾病和诸如与年龄相关的黄斑变性等疾病的新型治疗干预措施的巨大潜力.