建立基于异构酶的高通量查协议,使用Geobacillus sp. 甲基酸酶的使用

科学领域:

• 生物技术
• 酶工程
• 蛋白质工程

背景情况:

• 定向进化产生酶变异,但需要高通量选 (HTS) 来识别改进的功能.
• 通过色度测定可以检测到的活性,对D-粉素变异为D-粉素至关重要.
• 现有的选方法可能缺乏大型突变库所需的效率和准确性.

研究的目的:

• 建立一个强大的和可靠的高通量查 (HTS) 协议,用于选择高活性L-rhamnose异构酶 (L-RI) 变体.
• 优化和验证基于D-allulose耗尽量的L-RI活动的色度测试.
• 调整该协议以适用于蛋白质工程中大规模选的96孔板.

主要方法:

• 在单管格式中优化反应条件,以使用Seliwanoff反应准确测量D-allulose耗尽.
• 单管测定与高性能液态染色学 (HPLC) 验证以进行精确的量化.
• 调整试验到96孔板格式,包括细胞采集,上游物去除和过以最大限度地减少干扰.

主要成果:

• 优化方案准确量化了D-氨酸耗尽,与HPLC测量结果非常一致.
• 96孔板尺寸表现出高分析质量,Z'-因子为0.449,信号窗口 (SW) 为5.288,测定变异率 (AVR) 为0.551.
• 这些统计指标符合高质量的HTS测试的接受标准.

结论:

• 已经成功建立了可靠和有效的HTS检测L-RI活性方案.
• 该协议适用于在蛋白质工程工作中识别高活性异构酶变体.
• 开发的HTS方法在工业和研究环境中广泛适用于酶发现和优化.