通过使用序列共识设计和SpyTag/SpyCatcher自我循环的组合策略,提高RgDAAO的热稳定性和催化活性

科学领域:

• 生物化学和分子生物学
• 酵素工程是什么? 酶工程是什么
• 蛋白质工程是指蛋白质工程.

背景情况:

• 来自Rhodotorula gracilis的d-氨基酸氧化酶 (RgDAAO) 具有很高的反选择性,对于制药和化学合成至关重要.
• 由于RgDAAO的温度稳定性较差,因此阻碍了其广泛的工业应用.
• 提高酶的热稳定性对于高效的生物催化剂至关重要.

研究的目的:

• 制定一个协同策略,以提高RgDAAO的热稳定性.
• 通过蛋白质工程来提高RgDAAO的工业应用.

主要方法:

• 采用"顺序共识设计与结构修改相结合"的策略.
• 使用同源序列分析和一个贪的算法,用于定位突变 (S18T/V7I/Y132F三重突变,M3).
• 使用SpyTag/SpyCatcher系统构建的N/C终端自动循环变体.
• 对于一种组合酶变体 (LCDT-M3) 的组合突变和循环生成.
• 进行了分子动力学模拟和结构分析,以阐明稳定机制.

主要成果:

• 与野生型 (WT) 相比,三重突变M3的半衰期长3.7倍,化温度 (Tm) 增加5.13°C.
• 自动循环的变体在50°C的半衰期比WT高出2-3倍.
• 组合酶LCDT-M3的半衰期长12.8倍,Tm增加9.42°C,特异性活性在50°C时比WT高2.2倍.
• 结构分析表明,M3通过增强的局部键和减少的形状波动来稳定.
• 循环化减少了形状自由,促进了正确的折叠.

结论:

• 序列设计和结构修改的协同策略有效地提高了RgDAAO的热稳定性.
• 结合工程整合突变发生和循环生成产生了优越的酶变体,用于工业用途.
• 这种方法为改善工业相关酶的热稳定性提供了一个强大的框架.