细胞选择性多重化生物对等非法定氨基酸标记用于新生的蛋白质组学

科学领域:

• 生物化学 生物化学
• 分子生物学分子生物学
• 微生物学 微生物学

背景情况:

• 细胞选择性生物对等非规范性氨基酸标记 (BONCAT) 使用工程氨基酸-tRNA合成酶进行时间解析的蛋白质合成特征.
• 现有的细菌BONCAT方法通常依赖于甲基尼尔-tRNA合成酶 (MetRS-NLL),其速度和表达水平有局限性.

研究的目的:

• 扩大BONCAT在细菌中的范围和性能.
• 引入新型的工程氨基-tRNA合成酶 (EcTyrRS) 和氨基-tRNA合成酶 (EcTrpRS) 进行增强的蛋白质标记.
• 为了实现新的多重复合能力,并改善非模型细菌的时间分辨率.

主要方法:

• 工程 EcTyrRS 和 EcTrpRS 酶被开发用于细菌 BONCAT.
• 这些酶进行了测试,以确定它们是否能够将非正规氨基酸 (ncAA) 与明显的点击手柄相结合.
• 在速度,表达水平和强度方面,EcTyrRS和EcTrpRS的性能与MetRS-NLL相比较.
• 探索了多重复合能力,包括脉冲追踪实验和混合细胞群的标记.
• 该技术已在大肠杆菌和非模型ESKAPE病原体中得到验证.

主要成果:

• EcTyrRS和EcTrpRS能够在明显低于MetRS-NLL的表达水平上进行超快速的蛋白质组标记.
• 这些新酶提高了时间分辨率和强度,特别是在非模型细菌中.
• 无论是EcTyrRS还是EcTrpRS,都可以包含多个不同的ncAAs,从而促进多重蛋白质标记.
• 展示了新的多重复合策略,包括在不同条件下对新生蛋白质组的差异标记以及通过脉冲追踪精确的时间控制.
• 在混合种群中实现了不同细胞类型的相互直角蛋白质组标记.
• 在大肠杆菌和ESKAPE病原体中成功应用了增强的BONCAT技术.

结论:

• 设计的EcTyrRS和EcTrpRS显著提升了细菌BONCAT技术,提供了更高的速度,灵敏度和强度.
• 开发的酶解锁了先进的多重复合策略和精确的时间控制,用于蛋白质组分析.
• 这种扩展的工具包对于研究各种细菌中的蛋白质合成动态非常有价值,包括具有挑战性的非模型生物和病原体.