基于新热点"LOC"的重组CHO细胞的高效构建,以稳定表达治疗性蛋白质

科学领域:

• 生物技术是生物技术.
• 基因组学就是基因组学.
• 分子生物学分子生物学

背景情况:

• 有效地生成重组蛋白表达的中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞系对于生物制剂的开发至关重要.
• 通过CRISPR/Cas9介导的同质导向修复 (HDR) 提供了一种精确的基因插入到特定基因组位置的方法.
• 在CHO-K1细胞中先前发现的基因组"热点" (LOC位点) 提供了针对性基因整合的机会.

研究的目的:

• 建立和验证基因组"热点" (LOC位点) 以在CHO细胞中有效和稳定地整合基因.
• 开发一个集成的平台,结合CRISPR/Cas9和Bxb1重组酶介导的磁带交换 (RMCE) 快速细胞系的发展.
• 为了证明该平台能够稳定表达各种治疗蛋白质的能力.

主要方法:

• 利用CRISPR/Cas9将Bxb1的attP部位,EGFP磁带和促进体陷插入LOC部位,从而创建一个"着陆台" (LP) 细胞系.
• 在60代LP细胞中验证了稳定的EGFP表达.
• 采用Bxb1 RMCE,以高效的一步插入治疗基因 (GOI),并设有attB位点.

主要成果:

• 在LOC地点,在延长细胞培养过程中表现出稳定的基因表达能力.
• 在CRISPR/Cas9-Bxb1RMCE平台成功地集成了各种治疗性蛋白 (12-190 kDa),包括HSA,INFα2b,rFVII,AE01和ADAMST13.
• 在三周内产生了表达人血清白蛋白 (HSA) 的CHO细胞克隆,达到220 mg/L的标位.

结论:

• 该LOC站点作为一个验证的基因组"热点",用于在CHO细胞中插入向基因.
• 克里斯普尔/Cas9-Bxb1管道显著加速了用于生物制造的CHO细胞系的发展.
• 这种集成的平台能够有效和稳定地表达各种治疗性蛋白质.